1） 瘤細胞培養（無特殊要求）
骨髓瘤細胞呈懸浮或輕微附著形式生長， 如附著性生長的細胞多時， 用吸管輕輕吹打或輕輕 叩擊培養容器即可分離下來。 通常要維持細胞于指數生長期 （細胞培養時間為 15~20 小時） ， 5 6 每 3~5 天取細胞 0.2~1ml 移入到 10ml 新培養液中， 其最大細胞密度不能超過 5×10 ~10 /ml。 一般使用含有高糖的 DMEM 培養液，并補加有 pH 的穩定劑 HEPES。
2）免疫小鼠和脾細胞的制備
免疫小鼠：取 6~8 周齡 Balb/C 雌鼠，基礎免疫 2 周，靜脈再加強免疫一次，3~5 天后用于融合。
脾細胞制備： 1．引頸處死小鼠，用酒精消毒表體。
2．無菌條件下取出脾臟，剃除結締組織和脂肪，用 5ml 無血清培養液沖洗一次。
3．把脾臟置于已消毒的 90~100 目不銹鋼網或尼龍紗網中。
4．在脾中部切開一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無血清培養液沖洗，令細胞通 過紗網，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內注入 3 ml 無血清培養液，反復抽吸數次方 法獲取細胞，再制成細胞懸液亦可。
5．把細胞懸液注入 50ml 離心管中，加 10~20ml 培養液，輕輕吹打數次，室溫中置 5 分鐘。
6．離心（800~1000 轉/分）計數，備用。
3）飼細胞的制備：常用小鼠胸腺細胞或小鼠的腹腔細胞
飼細胞的制備：
小鼠腹腔細胞制備方法：
1．引頸處死小鼠，用酒精消毒表體。
2．切開腹部皮膚剝向兩側，暴露出腹壁。
3．用無菌 7 號針頭注射器，吸取 3ml 無血清培養液。
4．用小鑷夾起腹壁，注入 3ml 無血清培養液，用手反復輕輕揉腹壁，再反復抽吸 3~5 次。
5．收集末次吸得的細胞，注入 50ml 的離心管中，再加 20ml 無血清培養液，用吸管漂洗一 次。
6．離心，去上清，用含血清培養基調節細胞濃度為 2×105/ml，接種入培養板中，24 孔板 每孔加 0.1ml。
4）細胞融合
HAT 培養基的制備 [貯備液成分]100× 次黃嘌呤（Hypoxanthine: H） 胸腺嘧啶核苷（Thymidine: T） 氨基喋呤（Amiropterin: A） [HT 貯備液制備 貯備液制備]
1．稱取 136.1 mg H，38.8 mg T。
2．依次溶解在 100ml 雙蒸水中，H 難溶，可加溫 50~80℃促溶。
3．用 0.22 微米濾膜濾過除菌，每瓶分裝 2~5ml，-20℃冰箱貯存。
[A 貯備液制備 貯備液制備]
1．稱取 17.6mg A 到 90ml 雙蒸水中。
2．滴加 1M NaOH 溶液并不斷搖動，直至完全溶解，再滴加等量 1M HCl 溶液，恢復 pH 在 7.0 左右。 3．補足雙蒸水至最終體積 100ml。
4．0.22 微米濾膜濾過除菌，分裝，-20℃冰箱貯存。使用時，每 100ml 培養液（含血清）加 1ml HT 貯備液和 1ml A 貯備液。 1.0×10-2 M 1.6×10-3 M 4.0×10-5 M PEG（誘導劑）的制備（30%~50%）
1．取分子量 1000 的 PEG 高壓蒸氣滅菌（6.8 公斤，15 分鐘）
2．56℃水浴中融化后，37℃水浴中溫浴。
3．取無血清培養液 37℃水浴中溫浴（單獨）
4．配 40%濃度時，用刻度吸管吸 0.4ml PEG 和 0.6ml 無血清培養液混合、37℃水中溫育備 用。
細胞準備
1．收集骨髓瘤細胞，用無血清培養液洗 3 次（37℃） ，計數活力細胞（不少于 90%） 。
2．收集小鼠脾細胞，用無血清培養液洗 3 次（37℃） ，并計細胞數和測定活力細胞。
3．按 1：5 或 1：10 混合脾細胞和骨髓瘤細胞后，離心棄去上清，并以消毒濾紙吸凈多余上 清。
融合方法一：
1．將 1ml 40%的 PEG 液一滴滴加入到細胞團中，在 60 秒內加完，同時并不斷輕微轉動離 心管或用手指輕彈離心管。
2．在不斷轉動離心管中加 1ml 無血清培養液，60 秒鐘內加完。
3．于 5 分鐘內慢慢加完 20ml 無血清培養基。此時細胞對機械損傷非常敏感。
4．離心（800 轉/分，8 分鐘） ，去上清，用完全培養液 10ml 懸浮，輕輕混勻。
5．取 96 孔板，每孔加 50 微升。
6．取等體積細胞懸液，向另一 96 孔板中加 50 微升。
7．送入 5%CO2 溫箱中 37℃培養，24 小時后更換成 HAT 選擇性培養液。
方法二：
1．加 0.2ml 43%的 PEG 于離心管中。
2．用預先消毒的細玻璃針伸入管中輕輕攪動細胞團。
3．室溫中置 2 分鐘。
4．加入 10ml 完全培養液。
5．800 轉/分離心 5 分鐘。
6． 2 倍 HAT 培養液培養懸浮細胞， 24 孔板， 用 取 每孔中加 0.5ml， 96 孔板每孔中加 0.1ml。 另 7．5%CO2 溫箱，37℃，一周后第一次更換培養液，培養板中預先接種有飼養細胞，加 2× HAT 選擇培養液與原等量培養液混合后，即成為 1×的 HAT 培養基。
融合后細胞培養
1．融合后 7~10 天用 HAT 培養液變量換液，以后每隔 2~3 天半量換液一次。
2．兩周后可改用 HT 培養液半量換液，或仍用 HAT 培養液。
3．2~3 周后出現雜交細胞集落，細胞個大，圓且透明。
4．待集落增殖生長至 1/3 孔時，應進行抗體檢測。
克隆化培養 [軟瓊脂培養]
1．稱 1g 瓊脂粉，加入到 100ml 雙蒸水中，高壓蒸氣滅菌，4℃冰箱保存。
2．使用前，1%的瓊脂和 2×的 DMEM 培養液在 45℃水浴中分別溫浴。
3．二者等體積混合后，立即加入 1.5×107 小鼠脾細胞，混勻。
4．立即到入平皿中，每平皿（直徑 10cm）加 10ml，室溫中置 15 分鐘。
5．另取雜交瘤細胞懸液和 0.5%瓊脂等體積混合（0.25%瓊脂） ，加 2ml 到預先鋪有底層瓊脂 的瓶皿內。
6．CO2 溫箱培養。
7．10~15 天后，有細胞集落形成，適時移入 24 孔培養板中擴大培養。如用瓊脂糖，底層濃 度為 0.6%，上層為 0.3%瓊脂。
[有限稀釋法]
1．制備有飼養細胞底層的細胞培養板。
2．收集細胞、計數陽性培養細胞。
3．細胞懸液調至 5~10 個細胞/ml。
4．96 孔板中每孔加 0.1ml。
5．CO2 溫箱培養一周后，半量換液，繼續培養。
6．適時檢測每孔培養上清，挑選呈陽性培養孔的細胞繼續進行有限稀釋，直至確信孔中細 胞為單克隆為止。
7．進行擴大培養。
5）抗體的檢測 ） 常用方法：免疫熒光試驗、放射免疫試驗（RIA） ，酶聯免疫吸附試驗（ELISA）等。 胞的篩選 ELISA法。首次檢測時間在細胞融合后10天左右進行。
ELISA法所需試劑配置
包被緩沖液(pH9.6 0.05M碳酸鹽緩沖液):
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.93g
加蒸餾水至 1000ml
洗滌緩沖液(pH7.4 0.15M PBS):
KH2PO4 0.2g
Na2HPO4·12H2O 2.9g
NaCl 8.0g
KCl 0.2g
Tween-20 0.05% 0.5ml
加蒸餾水至 1000ml 包被抗原：pH9.6碳酸鹽緩沖液（CBS）稀釋抗原，加入到酶標板中，100μL/孔，37℃ 2小時或4℃過夜。甩干，洗滌3次，3分鐘/次。
封閉（血清或脫脂奶粉）：此步有時用，有時不用。
加被檢樣品（一抗），100μL/孔，37℃ 半小時，甩干，洗滌3次，3分鐘/次。
加酶標抗體（二抗），100μL/孔，37℃ 半小時，甩干，洗滌3次，3分鐘/次。
顯色： 5ml的顯色A液,5ml的顯色B液，100μL/孔，37 ℃反應10～20分鐘。
終止反應：加2M H2SO4，50μL/孔。
結果判定。肉眼或用酶標儀在450nm波長下測定OD值。
本實驗室目前采用洗板機進行洗滌。
