桿狀病毒毒種貯液的制備

實驗材料 桿狀病毒

試劑、試劑盒 胎牛血清重組病毒

儀器、耗材 培養箱培養瓶轉子

實驗步驟

從單層培養中制備：
 
1a.  以毎瓶1.8×107 Sf9細胞的密度，將細胞接種于兩個150 cm2 培養瓶，在含10%胎牛血清的完全培養液中培養。于27℃讓細胞貼壁3 h，然后移去完全培養液。以感染復數為0.1的病毒量，加入5 ml 含野生型或重組病毒的無血清完全培養液。于27℃溫育1 h。
 
2a.  去掉病毒接種物，代之以20 ml 10%胎牛血清的完全培養液，于27℃溫育1 h。每天在光學顯微鏡下檢查細胞有無包涵體出現或細胞病變效應。
 
3a.  當大多數細胞含有包涵體或顯示出細胞病變效應時（通常在感染后4至5天），收獲病毒。將感染的培養物移入滅菌試管中，于4℃以1 000 g 離心10 min，將上清移至一新的滅菌試管，分別吸取1 ml 的小份上清移至幾個螺口凍存管中，置液氮罐長期保存，將剩余的病毒毒種保存于4℃暗處。
 
從懸浮培養肀制備：
 
1b.  用50 ml 含10%胎牛血清的完全培養液在100 ml 旋轉培養瓶中培養Sf9細胞，不停地振蕩直到長至約2×106細胞/ml。于室溫以1 000 g 離心10 min 回收細胞，棄去上清。以感染復數為0.1的病毒量，加入含野生型病毒或重組病毒的10~20 ml 無血清完全培養液重懸細胞團塊。于室溫培養1 h。
 
2b.  用含10%胎牛血清的完全培養液將體積加至100 ml 將細胞置于100 ml 旋轉培養瓶中，于27℃培養3~4天，不停地振蕩。
 
3b.  當大多數細胞含有包涵體或顯示出細胞病變效應時，收獲感染細胞，如步驟3a所述加以處理。