李小波博士等發現光合作用所需的多個候選基因

　　萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）是一種非常有價值的真核模式生物，被廣泛用于與光合作用、呼吸作用、脂類合成、細胞運動（生物鞭毛）、非生物脅迫等生物學過程相關的功能研究（圖1）【1】。長期以來，通過同源重組將外源基因插入是敲除萊茵衣藻基因的主要方式，與外源基因的隨機插入等方式相比效率極低，而 CRISPR-Cas9，Cpf1 等基因編輯工具在萊茵衣藻中的使用效率還有待提高【1,2】。盡管已經建立了一些突變體庫，但覆蓋的基因數量非常少，分離其插入位點側翼序列的效率也很低，因此限制了萊茵衣藻的基因功能研究【1】。

圖1. 萊茵衣藻是眾多生物學過程研究的模式物種

　　2019年3月18日，普林斯頓大學Martin Jonikas （曾工作于斯坦福卡內基研究所，第一作者現為西湖大學PI李小波研究員）團隊聯合西湖大學等多家單位的科研人員在Nature Genetics在線發表了題為 A genome-wide algal mutant library and functional screen identifies genes required for eukaryotic photosynthesis 的研究論文。該研究利用多種自動化技術和高通量的測序技術建立了一個大規模萊茵衣藻的突變體庫，并通過篩選發現了光合作用所需的300多個候選基因。

　　研究人員利用隨機插入的方式將攜帶有特定序列的DNA片段插入到萊茵衣藻的基因組中，并通過 LEAP-Seq 獲取了每個克隆的插入位點信息（更多信息請參見參考文獻1和3）。該庫包括有6.2萬個突變體，覆蓋了約83%的編碼蛋白質的核基因，該突變體庫已經在2016年提前對全世界的研究者公開，在最開始的一年半已經為200多個實驗室（數據來源：李小波）提供了2000多個突變體。這些突變體已經被用來研究細胞水平的植物代謝、脅迫反應、表觀遺傳等多個過程。

　　光合作用是生物圈中最重要的化學反應（1988年諾貝爾化學獎頒獎詞）。然而，有證據表明還有很大一部分參與光合作用的基因還未被發現。 在維管植物中進行光合作用所需基因的遺傳篩選的主要難點包括：1）光合作用是必須過程；2）篩選通量有限，突變位點發現困難。而該萊茵衣藻突變體庫的建成使得大規模分離與光合作用相關的基因成為可能。

　　該研究利用萊茵衣藻可在黑暗條件下能夠異養生長的特點，把混合的突變體庫在光合自養與異樣的條件下的生長狀況進行對比，發現了數千個光合自養有缺陷的突變體，通過混池測序鑒定出了303個光合作用所需的候選基因，其中包括65個已知的和238個先前未知的光合作用所需基因（圖2）。

圖2. 從突變體庫中篩選出與光合作用相關的候選基因的功能分類示意圖

　　隨后，研究人員重點解析了一個新的蛋白磷酸酶（CPL3）的功能。結果表明 cpl3 突變體在光合作用過程中電子傳遞的速率與野生型相比出現了顯著降低，盡管兩者的葉綠體形態一致，但是cpl3 突變體中葉綠素 a/b 的比例與野生型的相比出現了明顯的下降。通過比較蛋白質組學分析發現，cpl3突變體中所有能檢測到的與葉綠體ATP合成酶（ATPC, ATPD, ATPG, AtpA, AtpB, AtpE, and AtpF）相關亞基的表達豐度都出現了顯著的降低，此外，PSI（PsaA and PsaB）和PSII（D1, D2, CP43, CP47, PsbE, and PsbH）的一些組成成分的表達豐度也出現了下降（圖3）。該結果表明 CPL3 是光合作用光反應所需蛋白復合體的正常積累所必需的。

圖3. 光反應蛋白復合體等蛋白質在 cpl3 突變體與 WT 中的相對豐度

　　近年來利用藻類中的進行合成生物學的研究越來越多，適用與能源、營養添加劑、藥用天然產物等領域。萊茵衣藻是真核藻類中工具比較全的系統，而且也有研究組（UCSD Steve Mayfield）在試圖大規模培養，以用于藥用蛋白的生產等。這個突變體庫對于合成生物學前期的基因功能發掘具有重要意義。

　　本項研究由六家單位合作完成，包括普林斯頓大學、斯坦福卡內基研究所、 西湖大學、斯坦福大學、加州大學舊金山分校和明尼蘇達大學。西湖大學李小波研究員為該論文的第一作者。

　　專家點評

　　楊文強 研究員 （中科院植物所）

　　綠藻與陸地植物在進化上有著緊密的親緣關系，大約在5億年前分開。單細胞綠藻由于生長周期短等優點可以被用作植物學研究的模式生物。其中，萊茵衣藻三個基因組（核基因組、葉綠體基因組和線粒體基因組）測序已經完成，容易轉化和雜交等優點已經被廣泛地用于光合作用、碳濃縮機制、色素代謝、溫度脅迫、厭氧與發酵、細胞分裂、鞭毛與疾病、光遺傳學等過程的研究。尤其是葉綠體發育和光合作用調控等方面的高度保守性和相似性，是衣藻成為一種炙手可熱的模式生物。近年來，衣藻與高等植物共進化方面的研究也逐漸嶄露頭角。在過去的20 年里，衣藻研究的主要障礙是對于特定的基因，人們很難獲取相應的突變體，這就大大限制了從遺傳角度展開功能基因組學的研究。基于同源重組的基因敲除等技術在衣藻中成功率較低，而CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1 等基因編輯技術也僅在近年被報道，且效率較低。一個突變位點已知并能長期穩定保存的突變體庫將大大提高萊茵衣藻中的反向與正向遺傳學研究的效率。

　　李小波博士在Martin Jonikas 團隊工作時領導了萊茵衣藻突變體庫建立的項目。他們首先開發了高通量的突變體繼代技術與中等通量的插入突變定位技術，建立了小規模的試驗突變體庫（~1900個突變體；Li#, Zhang#, Patena# et al. 2016 Plant Cell）。近期，李小波博士等建立了更高通量、更高準確率的突變定位技術，利用這些技術對20萬個衣藻突變體中的13萬個進行了成功的突變定位，在去除了一部分基因的冗余突變體后將6萬多個突變位點已知的突變體穩定保存下來。插入位點近乎均勻地分布在萊茵衣藻的17條染色體上（見論文圖1）。在這個大型突變體庫中，他們還對每一個突變體插入了特異的DNA條形碼序列，并利用混池測序技術對生物圈中最重要的化學反應-光合作用所需的基因展開了高通量篩選，共獲得數千個光合作用有缺陷的突變體，發現了光合作用所需的300多個候選基因。李小波博士在西湖大學成立實驗室后，對其中的一個潛在的蛋白磷酸酶突變體進行了初步的機理研究。這些工作近期被發表于Nature Genetics （Li et al. 2019 Nature Genetics）。

　　專家點評

　　范建華 教授 （華東理工大學）

　　萊茵衣藻是真核微藻領域的模式藻株，其細胞結構獨特，遺傳學背景清晰，目前已成功實現了細胞核、葉綠體和線粒體基因組的遺傳轉化，是真核微藻中研究最為成熟的表達系統/基因編輯體系。目前已有大量的外源蛋白（如報告基因、藥用蛋白、工業酶、抗體、疫苗、細胞因子等）成功實現表達。作為模式生物，萊茵衣藻的核基因組、線粒體和葉綠體基因組的測序工作已全部完成，這為利用萊茵衣藻人工設計外源基因、成功實現表達與調控提供了巨大的方便，現已被認為是最有前途的“綠色細胞工廠”。

　　近年來，真核微藻的合成生物學研究主要集中在萊茵衣藻，利用合成生物學技術改造衣藻可生產木糖醇、倍半萜、霍亂、瘧疾疫苗和免疫毒素等化學產品和重組蛋白。相對于原核微藻，真核微藻細胞具有蛋白翻譯后修飾途徑，對特定蛋白的生物活性不可缺少。然而，微藻合成生物學特別是底盤的優化研究仍處于一個初始階段，在抗逆元件挖掘解析、光合效率的優化、耐受性底盤的優化、合成產物的細胞器靶向運輸以及富集等方面亟待研究。李小波研究員的論文通過構建基因組飽和的萊茵衣藻突變體庫，建立高通量的智能篩選方法，首次突破全基因組尺度的微藻底盤光合作用及逆境耐受的功能元件挖掘解析，有望拓展和完善萊茵衣藻的基因組遺傳操作平臺，并為突破自養型真核綠藻細胞人工設計和生物合成體系的大規模工業化應用奠定基礎，具有重要的科學意義和應用價值。

　　參考文獻

　　1. Li, X. et al. An indexed, mapped mutant library enables reverse genetics studies of biological processes in Chlamydomonas reinhardtii. Plant Cell 28, 367–387 (2016).

　　2. Slaninová, M. et al. Is it possible to improve homologous recombination in Chlamydomonas reinhardtii Biologia 63: 941–946 (2008).

　　3. Zhang, R. et al. High-throughput genotyping of green algal mutants reveals random distribution of mutagenic insertion sites and endonucleolytic cleavage of transforming DNA. Plant Cell 26, 1398–1409 (2014).