楊輝組／高彩霞組發現單堿基編輯系統存在嚴重脫靶效應

　　2016年，David Liu團隊在 Nature 期刊上首次報道了基于胞嘧啶脫氨酶APOBEC1（能催化C脫氨基變成U，而U在DNA復制過程中會被識別成T）和尿嘧啶糖基化酶抑制劑UGI（能防止尿嘧啶糖基化酶將U糖基化引起堿基切除修復）的單堿基編輯工具（BE3）首次實現可以在不引入DNA雙鏈斷裂的情況下對單堿基進行替換【1】，2017年該團隊在Nature上發表論文報道了另一種單堿基基因編輯工具——腺嘌呤堿基編輯器 (ABE)【2】，它可以將A?T堿基對轉換成G?C堿基對，加之2016報道的將G?C堿基對轉換成T?A 堿基對的成果，從此研究人員首次實現了不依賴于DNA斷裂而能夠將DNA四種堿基A、T、G、C進行替換的單堿基基因編輯技術（目前上述兩篇Nature論文總被引次數已超千次）。

　　單堿基編輯器的開發，為定向編輯和修正基因組中的關鍵核苷酸變異提供了重要工具，由于該技術不引入DNA雙鏈斷裂，因此展現了其在遺傳疾病治療與動植物新品種培育等方面潛在的重大應用價值。然而值得注意的是，CRISPR/Cas9從問世以來，其脫靶風險一直備受關注，如果將CRISPR/Cas9及其衍生工具貿然用于臨床的話，脫靶效應可能會引起包括癌癥在內的很多種副作用。盡管此前人們推出過多種檢測脫靶的方案，然而由于過去的方法或者依賴于計算機軟件預測，或者依賴于高通量測序檢測DSB產生，還有體外檢測的方法。這些方法都存在一些局限性，不能高靈敏性檢測到脫靶突變，尤其是單核苷酸突變。因此關于CRISPR/Cas9及其衍生工具的真實脫靶率一直存在爭議。那么一種能夠突破之前限制的脫靶檢測技術，將會成為CRISPR/Cas9及其衍生工具是否能最終走上臨床的關鍵。人們迫切希望可以找到一種既能夠不依賴于脫靶位點預測，又能有足夠信噪比的精密脫靶檢測手段。

　　北京時間2019年3月1日凌晨，Science雜志“背靠背”在線發表了兩篇來自中國科學家完成的研究論文，分別用不同的方法在不同的物種上首次發現了單堿基編輯系統存在嚴重的脫靶效應，這給當前如火如荼開展的相關臨床試驗蒙上了一層陰影。

　　題為Cytosine base editor generates substantial off-target single nucleotide variants in mouse embryos的研究論文由中科院神經科學研究所（中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心）、上海腦科學與類腦研究中心楊輝研究組與中科院上海營養與健康研究所隸屬的計算生物學研究所（中國科學院-馬普學會計算生物學伙伴研究所）李亦學研究組、斯坦福大學遺傳學系Lars M. Steinmetz研究組以及中國農業科學院深圳農業基因組研究所的研究人員合作完成。

　　該研究探索了全基因組范圍內基因編輯技術可能造成的脫靶效應，建立了一種被命名為GOTI（Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection）的新型脫靶檢測技術，并使用該技術發現: 近年來興起的單堿基編輯技術有可能導致大量無法預測的脫靶，因而存在嚴重的安全風險。此研究顯著提高了基因編輯技術脫靶檢測的敏感性，并且可以在不借助于任何脫靶位點預測技術的情況下發現之前的脫靶檢測手段無法發現的完全隨機的脫靶位點，為基因編輯工具的安全性評估帶來了突破性的新工具，有望成為新的行業檢測標準。

　　如果要提升檢測脫靶效應的精度，就必須徹底顛覆原有的脫靶檢測手段。首先，為了實現不借助于脫靶位點預測，這就要求必須找到非常嚴格的對照組來確定基因突變的位點；同時為了檢測不依賴于sgRNA的隨機突變，最好使用基于單細胞全基因組測序。為了實現以上目標，楊輝研究組與合作者建立了一種名叫“GOTI”的脫靶檢測技術。研究者們在小鼠受精卵分裂到二細胞期的時候，編輯一個卵裂球，并使用紅色熒光蛋白將其標記。小鼠胚胎發育到14.5天時，將整個小鼠胚胎消化成為單細胞，利用流式細胞分選技術基于紅色熒光蛋白，分選出基因編輯細胞和沒有基因編輯細胞，再進行全基因組測序比較兩組差異（下圖），這樣就避免了單細胞體外擴增帶來的噪音問題。而且由于實驗組和對照組來自同一枚受精卵，理論上基因背景完全一致，因此直接比對兩組細胞的基因組，其中的差異基本就可以認為是基因編輯工具造成的。

圖片來自Science論文

　　在楊輝實驗室全體成員與合作單位的共同努力下，GOTI系統被成功建立了起來。借助于這個系統，團隊成員先是檢測了最經典的CRISPR/Cas9系統。結果發現，設計良好的CRISPR/Cas9并沒有明顯的脫靶效應，這個結果結束了之前對于CRISPR/Cas9脫靶率的爭議。然而團隊還檢測了另一個同樣被給予厚望的CRISPR/Cas9衍生技術單堿基編輯系統BE3和ABE，這個系統可以精確引入點突變，在之前的研究中從未發現過有明顯的脫靶問題。在GOTI的檢測下發現，ABE系統同樣表現出非常高的特異性，然而BE3存在非常嚴重的脫靶，而且這些脫靶大多出現在傳統脫靶預測認為不太可能出現脫靶的位點，因此之前方法一直沒有發現其脫靶問題。

　　在BE3編輯的胚胎中，平均有283個 SNVs被檢測到，相比于Cre或CRISPR/Cas9處理組增加了20倍以上。而這些突變90%以上都呈現出G到A或者C到T的模式，進一步表明這些突變不是胚胎發育過程中隨機產生的突變，而是由于BE3編輯所導致。這些突變隨機分布于基因組中，有許多會影響蛋白的編碼，甚至有一些位于原癌基因（Pin1）和抑癌基因（Rsu1, Stk4, Tsc1, Park7, Rbpj, Ing3, Hipk2, Phlpp2, Yeasts4, Ptch1, Stk3, Smchd1）上的突變，這意味著這些脫靶突變可能會進而引起癌癥的發生，具有潛在風險，也就是說BE3系統不適合在臨床上使用。

　　總的來說，上述重要發現，證實了以BE3為代表的部分基因編輯技術存在無法預測的脫靶風險，讓世人重新審視了這些新興技術的風險。更重要的是，此工作建立了一種在精度、廣度和準確性上遠超越之前的基因編輯脫靶檢測技術，有望由此開發精度更高、安全性更大的新一代基因編輯工具，建立行業的新標準。

　　值得一提的是，上述工作曾在“基因編輯嬰兒事件中”發生后的第二天就上傳到生命科學預印本雜志BioRxiv上

　　據悉，該工作從實驗設計到全部完成歷時一年半左右，中科院神經所博士后左二偉（現任中國農業科學院深圳農業基因組研究所研究員）、計算生物學所博士研究生孫怡迪和魏武研究員、中國農業科學院深圳農業基因組研究所助理研究員袁堂龍為本文共同第一作者，楊輝研究員、李亦學研究員以及斯坦福大學Lars M. Steinmetz教授為本文共同通訊作者。

　　題為Cytosine, but not adenine, base editors induce genome-wide off-target mutations in rice的研究論文由中科院遺傳與發育研究所高彩霞研究組完成。該研究在水稻中對BE3 (基于融合rAPOBEC1胞嘧啶脫氨酶的CBE系統)、HF1 -BE3（高保真版本BE3）與ABE單堿基編輯系統的特異性進行了全基因組水平評估，首次在體內利用全基因組測序技術全面分析和比較了這三種單堿基編輯系統在基因組水平上的脫靶效應。

　　該研究對經過不同單堿基編輯系統轉化的的56棵T0代水稻植株與21株對照植株進行全基因組測序。進一步序列統計分析發現，經過單堿基編輯系統處理后，基因組內的插入或刪除（indels）突變的數量與對照組相比沒有顯著變化，但是BE3與HF1-BE3，無論是在有無sgRNA的情況下，均可在水稻基因組中造成大量的單核苷酸變異(SNVs)，且大部分為C>T類型的堿基突變。與經過農桿菌轉化但不含任何堿基編輯系統的對照植株相比，BE3系統和HF1-BE3系統處理的植株在基因組范圍內的C>T SNVs分別增加了94.5%和231.9%，額外產生了98個C>T SNVs和242個C>T SNVs。重要的是，與Cas-OFFinder軟件預測結果比較發現，這些額外增加的C>T SNVs絕大多數發生在不是現有軟件可以預測到的脫靶位點。此外，這些C>T變異在染色體間均勻分布，但呈現出在轉錄活躍區富集的趨勢。這些區域傾向于釋放單鏈DNA為胞嘧啶脫氨酶提供合適的底物。研究還發現，與CBE系統相反，ABE系統表現出非常高的特異性。ABE處理的植株與對照植株在全基因組范圍內的SNV數量基本一致。

　　總的來說，該研究表明現有BE3和HF1-BE3系統，而非ABE系統，可在植物體內造成難以預測的脫靶突變，因此，需要進一步優化提高特異性。該工作創新性地利用相似遺傳背景的克隆植物及全基因組重測序解決了以前大量異質細胞序列分析的復雜性。

　　據悉，高彩霞研究組博士生靳帥、宗媛以及梁承志研究組工作人員高強為本文的共同第一作者，高彩霞研究員為本文的通訊作者。

　　原文鏈接：

　　http://science.sciencemag.org/content/early/2019/02/27/science.aav9973

　　http://science.sciencemag.org/content/early/2019/02/27/science.aaw7166

　　參考文獻

　　1、 A. C. Komor, Y. B. Kim, M. S. Packer, J. A. Zuris, D. R. Liu, Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420-424 (2016).

　　2、Gaudelli, N. M., Komor, A. C., Rees, H. A., Packer, M. S., Badran, A. H., Bryson, D. I., & Liu, D. R. (2017). Programmable base editing of A? T to G? C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature, 551(7681), 464.