(1)樣品洗畢后(見前)，懸于含1％正常羊IgG的中。在1．5ml錐形管中胚胎或其他樣品所占體積應少于50txl，或在5mlap-top管中應少于200／A。搖動孵育1h。
(2)用洗2次。
(3)加一抗：用含蛋白質的溶液，如含羊IgG的制備不同稀釋度的抗體。單克隆抗體最好來自雜交瘤細胞培養上清(特異性抗體濃度為20—50ug／m1；以1：10稀釋度作起點為佳)。小鼠腹水或純化的單克隆抗體和多克隆抗體以及粗制的多克隆抗血清應測試一定范圍內的稀釋度，從而使特異性抗體濃度達到0．01—1Pg／ml。如果特異性抗體濃度是未知的，應制備并測試原始制品的不同稀釋度(1：10，1：100，1：1000和1：10000)。
(4)在4℃孵育24h。
(5)用洗3次，每次5min以上。緩沖液中可以含1％TritonX-100或-40，以降低背景。
在此方法中，以未免疫的羊IgG作為封閉劑，即從正常羊血清中通過蛋白G純化制備。因本文推薦的標記二抗是羊抗鼠(或兔)免疫球蛋白抗體，故選擇羊IgG作為封閉試劑。如使用的是另一來源的標記二級試劑，則應改用其他封閉劑，如可選用3％牛血清白蛋白。
(6)加標記的二級試劑：用含蛋白質的溶液，如1％正常羊IgG／制備不同稀釋度的二級試劑。常用的二抗試劑包括抗免疫球蛋白抗體、蛋白A或蛋白G。一般而言，建議使用辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠(或兔)免疫球蛋白二抗。標記的二級試劑可以購自供應商，如使用商業來源的標記二級試劑，其稀釋度可從1：50至1：1000。堿性磷酸酶標記的試劑應用Tris緩沖液稀釋，而不用。
(7)加標記的二抗試劑，4℃孵育1h。
(8)用洗3次，每次5min以上。中可以含1％TritonX-100或-40，降低背景。
(9)將6mgDAB溶解在9m10．05mol／LTris緩沖液中(pH7．6)。
(10)加入lml 0．3％(W／V)氯化鎳貯液，也可用等量的氯化鈷替代。
(11)加0．1ml 3％過氧化氫溶液(用水配制)，通常供應的過氧化氫為30％，4℃下可保存1個月左右。
(12)如果有沉淀出現，可用Whatmanl號濾紙(或相應的)過濾。
(13)將底物溶液加至樣本中，孵育1—20min，用水沖洗終止反應。在顯微鏡下觀察顏色的變化以便判斷終止反應的適當時間。
(14)優化選擇：在高倍鏡下觀察胚胎時，胚胎的直觀視覺模式和通過胚胎的光路長度常引起標本出現不透明的現象。為了克服這一特點，通常用不同的試劑處理胚胎，這樣將能改變胚胎的折射指數。可將胚胎在甘油或甲基水楊酸鹽溶液中孵育。對于大多數染色標本以甘油效果較好。
將胚胎重懸于500弘l的甘油／(50：50)混合液中，于室溫下孵育1h。
離心胚胎，重懸于70：30的甘油／混合液中。
經過甲基水楊酸鹽溶液處理的標本清晰度比甘油更好，但它易揮發，使一些工作者難于忍受這種氣味。此外，它沒有黏度，使得對胚胎的處理較容易。可先將胚胎通過一系列乙醇處理：50％l醇5min，70％乙醇5min，90％乙醇5min，100％乙醇5min，各2次。再加500~1甲基水楊酸鹽溶液，作用10min，不應搖動試管。胚胎將沉到底部。去除上清并加新鮮的甲基水楊酸鹽溶液。最后用甘油代替甲基水楊酸鹽溶液。
(15)樣品觀察：將用甘油洗過的樣品轉到玻片上。在解剖顯微鏡下觀察胚胎，并挑選一部分在高倍鏡下檢查。
在一潔凈的載玻片上放2張蓋玻片(井1)，中間間隔lcm，以準備一個觀察小室。在這間隔區加上70：30的甘油／溶液。由于毛細作用就可以使該溶液進入蓋玻片下。將所研究的胚胎轉至該觀察區，并蓋上第3張蓋玻片。應避免氣泡的形成。來回推蓋玻片，以便尋求到最佳方向進行觀察。
(16)觀察并照相。