枝角類(Cladocera)通稱溞類,俗稱紅蟲或魚蟲,它是一類與昆蟲近親的小型甲殼動物,廣泛分布于自然水體中,是魚類的天然餌料。枝角類繁殖力強,生活周期短,容易培養,因此也是一類很好的試驗動物。溞類對許多毒物(特別是重金屬和有機磷農藥)比其他水生動物要敏感。當含有農藥等有毒廢水排入水體時,往往先引起類的死亡,破壞水生生態系統的平衡,從而影響魚類的生長。因此在制定漁業水體水質標準和工業廢水排放標準時,常配合魚類毒性試驗而被廣泛采用。
(1)試驗類及其選擇用來進行毒性試驗的溞應具有一定的代表性,對毒性要比較敏感,而且應來源豐富。我國有溞130多種,試驗常用的有大型溞、溞狀溞、隆線溞和多刺裸腹溞等,前三種都比較大,試驗更為方便。
溞類的生殖方式有兩種,即孤雌生殖和有性生殖。孤雌生殖產卵很多,不需要受精就能發育成個體(大多是雌體),到秋末冬初或遇到環境不良時,才能有雄體產生,然后進行有性生殖。因此,一種溞在整個生活史中會出現三種個體,即雄溞、孤雌生殖溞和有性生殖溞,它們對毒物的敏感性不同,試驗時應該用純一個體。孤雌生殖溞數量很多,一般試驗均采用這種個體。另外,不同齡期的溞對毒物的敏感性不同,老年個體敏感性差,故不宜作為試驗材料,試驗通常采用出生后2~4d的幼溞。
(2)試驗的培養和馴化 Banta(1921年)建議用馬糞(風干)170g,菜園土2000g,加過濾池水10L,在室溫15~18℃下經3~4d,用細篩過篩,再用過濾水稀釋2~4倍,便可使用。這種培養液為 Banta液,效果很好,至今仍被采用。
試驗前把懷卵的孤雌生殖溞用吸管吸出,分開飼養,經24h后,這批雌溞所產生的幼溞經吸出或用塑料紗過濾分離后,再養2~4d就可用作試驗溞。
(3)試驗條件 容器:溞類培養可用水族箱、搪瓷桶、陶瓷缸、玻璃缸和燒杯等容器,培養最好在恒溫設備中進行,并可適當曝氣。
試驗用水:池水、河水、井水均可作為試驗水,但必須清潔,水中懸浮物應當濾除用水一般要經活性炭過濾,必要時用紫外線消毒。用自來水時必須人工曝氣或靜置1~2d,去除余氯。試驗水溫要求在20℃左右,pH=8~9,溶解氧不能低于4mg/L,氯度(Cl-)500~2000mg/L
(4)試驗步驟 枝角類毒性試驗分為預備試驗和正式試驗兩部分。
①預備試驗。在做正式試驗前,為了確定試驗濃度范圍,必須進行預備試驗。預備試驗的濃度范圍可廣些,每個濃度2~3個溞就可以。根據試驗要求的時間(24或48h)找出大部分不死亡的濃度。一次找不準確,可再做二次或多次,直至找到正式試驗所用濃度范圍。
對于耗氧量大或變化快的試驗物質,最好用流水裝置進行試驗。
②正式試驗。選擇濃度的方法與魚類試驗相同。每個濃度要有2~3個平行試驗,另外設一對照。正式試驗至少要重復兩次。試驗毒物溶液配制時,要先配成母液,再稀釋至所需濃度。
用作試驗的溞,先移至表面皿,在體視顯微鏡或放大鏡下進行檢查、過數,然后再移入試驗液。急性試驗時,用80mL小燒杯裝50mL試驗水,每杯放10個溞。
通過溞類毒性試驗可以求得半致死濃度(LC50)或叫半忍受限(half tolerance limit,HTL),以反映污染物或有毒廢水對溞類的毒性。半忍受限用在規定時間內引起溞類半數死亡的藥物濃度來表示,用直線內插法求得(參考魚類毒性試驗)。死亡標準掌握的尺度直接關系到所求的數值,一般用停止活動(沉到水底不動)作為死亡的標準。
枝角類急性試驗一般為48h,也有用24h或96h的,急性毒性試驗一般不喂食。
5.發光細菌毒性檢測
發光細菌檢測法是以一種非致病的明亮發光桿菌作試驗生物,以其發光強度的變化為指標,測定環境中有害有毒物質的生物毒性的方法。
細菌的發光過程是菌體內一種新陳代謝的生理過程,是呼吸鏈上的一個側支,即菌體是借助活體細胞內的ATP、熒光素(FMN)和熒光素酶發光的,綜合化學反應過程為:
FMNH2+2RCHO2+O2 細菌熒光酶 FMN+2RCOOH+H2+hv
該光波長在490nm左右,這種發光過程極易受到外界條件影響,凡是干擾或損害細菌呼吸或生理過程的任何因素都能使細菌發光強度發生變化。當有毒物質與發光菌接觸時,可影響或干擾細菌的新陳代謝,從而使細菌的發光強度下降或熄滅,這種發光強度的變化,可用精密測光儀定量測定。有毒物質的種類越多,濃度越大,抑制發光的能力也越強,對于氣體中的可溶性有毒物質可以通過把它吸收溶解到液體中,然后測試其對發光細菌的影響。在一定濃度范圍內,有毒物質濃度與發光強度呈一定的線性關系,因此可利用發光細菌來監測環境中的有毒污染物。
目前,國內外采用的發光細菌實驗有三種測定方法:①新鮮發光細菌培養測定法;②發光細菌和海藻混合測定法;③冷凍干燥發光菌粉制劑測定法。