染色體基因定位實驗

在進行定位時，首先要使標記物與探針相接合（Lable：標記），形成探針/標記物復合物，然后再使復合物與染色體DNA 進行雜交（Hybridization）。所謂雜交，即兩條來源不同的單鏈DNA能互補形成雙鏈DNA的過程。在一般情況下，染色體上被定位的目的基因和探針都是雙鏈狀態的DNA，兩者雜交只有在解鏈狀態下，即都變成單鏈時才能發生。溫度是使雙鏈DNA解鏈的條件，在80 ℃溫度下DNA即發生解鏈（變性）。因此當把染色體與探針置于同溫條件下，兩者便同時解鏈成為單鏈DNA；當溫度下降時，兩者DNA又重新恢復雙鏈狀態（復性）；在復性中探針的單鏈即可與目的基因單鏈發生雜交。由于探針DNA 攜有標記物，用相應的方法能使標記物顯現成為可見形態。在用同位素作標記物時，可用放射自顯影法顯現探針/同位素；用熒光素作標記物時，探針/熒光素能在熒光顯微鏡下發光，從而可觀察到和確定探針的位點（也即目的基因存在位點）。標記探針與染色體基因（或細胞質mRNA）雜交定位法稱原位雜交（In Situ Hybridization）。

染色體標本

放射性核素

一、放射性核素探針摻入程序

1.  探針制備

2.  缺口翻譯

（1）同位素減壓濃縮

取3H-dTTP（1 μC/ml）50 μl～100 μl，置入Eppendorf管中真空中減壓抽干；

（2）缺口翻譯反應

另取探針DNA1 μg加入Eppendorf管中，再加入10×缺口翻譯緩沖液5 μl；

缺口翻譯緩沖液組成為
 

Tris-Cl 緩沖液 0.5 M

MgSO₄ 0.1 M

二硫蘇糖醇 1 mM

牛血清白蛋白 500 μg/ml

（3）再加入dATP、dGTP、dCTP 各1 mM；用蒸餾水稀釋至50 μl；

（4）混合

移入已真空干燥含有3H-dTTP的Eppendorf管中，混勻；

（5）加酶

加入DNA 聚合酶I、DNA多聚酶I各1 ml，封口；

（6）反應

16 ℃中反應10 分鐘，加0.5 M EDTA終上反應；

（7）探針分離

將上述反應液加入Sephadex G50層析柱中，用TE洗脫分離。

二、探針與染色體分子原位雜交

1.  雜交液配制
 

³H 標記探針 1.0 μg/ml

甲酰胺 50.0 %

硫酸葡萄糖 10.0 %

EDTA 5.0 mM

聚乙烯吡咯烷酮 0.04 %

聚蔗糖 0.04 %

牛血清白蛋白 0.04 %

氯化鈉 300 mM

檸檬酸鈉 300 mM

磷酸鹽緩沖液 20 mM

小牛胸腺DNA 50 μg/ml

以上成分相混合，pH7.0±0.1。
 

2.  探針變性

將雜交液混合，置于70 ℃水浴中，作用5 分鐘后，再把含有雜交液的小管插入碎冰中。

3.  染色體DNA 變性
 

（1）在每張染色體標本上，加100 μg/ml RNA酶50 μl（為去除RNA），置一蓋玻片，置于潮濕皿中，37 ℃孵育1 小時；去除蓋片，浸入2×SSC 缸中漂洗4 次；

（2）脫水

過70％、80％，90％、100％酒精脫水；

（3）變性

置染色體標本入2×SSC 甲酰胺溶液中，70 ℃處理2 分鐘（不能過長）；

（4）迅速投入30％冷乙醇溶液中；

（5）脫水

同(2)；

（6）干燥

自然干燥。

4.  探針與染色體雜交

（1）每一染色體標本上加雜交液50 μl，覆一蓋片；42 ℃于潮濕皿中雜交16 小時；

（2）洗脫

30～40 ℃下，50％甲酰胺溶液中洗5 次、2×SSC 溶液中洗5 次，0.1×SSC溶液洗3 次（洗脫過分影響雜交率）；

（3）脫水

與前相同；

（4）干燥

自然干燥。

5.  放射自顯影
 

（1）涂片

用國產核子乳膠（1：1）稀釋液涂片；

（2）曝光

4 ℃冰箱中曝光10 天后（比活性10⁷ cpm/μg 以上），取出；

（3）顯影

用D19B 顯影液，顯影2～5 分鐘；

（4）定影

柯達F-5 定影液定影10 分鐘；

（5）水洗

15 分鐘。

6.  染色體顯帶
 

（1）置已曝光片子浸入下液中
 

Na₂SO₄ 50.0 mM
 

Na₂B₄O₇ 2.5 mM
 

37 ℃，預處理10～30 秒；

（2）染色

迅速漫入10％Giemsa染色液中染2～3 分鐘；

（3）水洗、干燥、鏡下觀察。

一、結果

成功情況下可見：染色體分帶良好、除染色體外，在各處可見散在的、直徑1～3 微米的黑色圓形顆粒，有的顆粒位于染色體上，有的位于染色體間。觀察50～100 個分裂相，并統計顆粒存在于某號染色體上規律性位點、統計、在特定染色體的特定位點出現機率占8％～40％以上者，可視為該基因的位點。

二、討論

染色體DNA變性充分，利于與探針雜交，但變性過度不利顯帶。變性中加70％甲酰胺效果較好，能保證在較低溫度下進行變性和維持染色體形態。雜交液中加10％的硫酸葡聚糖較好，有提高雜交率作用，但不能過高，否則本底亦高。探針濃度亦應適當，過低需延長曝光時間，本底隨之增加；過高探針可自相結合影響雜交率。加入探針的量與DNA片段大小有關，經驗數值是，10 kb片段DNA濃度應為0.5～0.05 mg/L。