油脂水解產物中游離脂肪酸的檢測主要利用氣相色譜法, 但預處理步驟較為繁瑣, 需要通過改變水解產物pH 值或利用薄層色譜預先將游離脂肪酸分離。柱前衍生HPLC 法測定游離脂肪酸不需要分離游離脂肪酸的前處理, 且HPLC 檢測分離溫度較低, 脂肪酸熱降解程度大大降低, 具有氣相色譜法無可比擬的優越性而得到了廣泛的應用。利用柱前衍生HPLC 法測脂肪水解產物中游離脂肪酸的研究國外已有論文發表 。
一、實驗儀器
Agilent -1100 型高效液相色譜、Zorbax SB -C18柱:美國安捷倫科技有限公司。
二、色譜條件
洗脫程序:初始流動相∶乙腈∶水(5∶95)經15 min梯度洗脫變化至100 %乙腈, 繼續洗脫17 min ；體積流量1 .6 m L/min ；柱溫:25 ℃；檢測波長254 nm ；進樣量20 μL , 利用外標法進行定量分析。
三、衍生化處理
準確稱取等量的2 , 4 -二溴苯乙酮和18 -冠-6醚配制成一定濃度的衍生化溶液, 置于4 ℃條件下避光保存；分別稱取肉豆蔻酸、硬脂酸、油酸和亞油酸0 .164 、0 .333 、0 .772 、0 .286 g , 以甲醇和二氯甲烷1∶1(v∶v)混合溶液定容至100 mL 待用。取上述脂肪酸標準溶液0 .15 mL 于具塞反應管中, 加入相應濃度的衍生化試劑3 mL , 另加入0 .4 g 碳酸鉀已形成pH值為8 .3 ～ 8 .5 的緩沖體系。混合物于80 ℃水浴中加熱30 min , 反應液置于4 ℃條件下冷卻1 h , 過0 .45 μm濾膜后, 待HPLC 分析。準確樣品0 .15 g , 以甲醇和二氯甲烷1∶1(v∶v)混合溶液定容至10 mL, 加入1 g 無水硫酸
鈉脫去酶解物中的水, 4 200 r/min 離心5 min , 取上清液0 .15 mL , 按上述中脂肪酸標準品衍生化步驟處理, 所得樣品待HPLC 分析。
四、統計分析
選用OriginPro 7 .5 軟件(OriginLab Corporation ,Northampton , USA)對數據進行單邊方差分析(ANOVA)。顯著性分析采用LSD 檢驗, 顯著性水平采用0.05 。