標記抗體的應用技術——BAELISA

抗體

血清親和素

塑料板檢測儀加樣器滴頭毛巾洗滌瓶燒杯玻璃棒試管吸管量筒冰箱孵育箱

一、用于檢測未知抗原的BA-ELISA

1.  包被抗體

用0.05 M PH9.6碳酸鹽緩沖液將已知抗體作適當稀釋，在每個聚苯乙烯酶標板的反應孔中加0.1 ml，4 ℃過夜（18-24小時）。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3 分鐘（簡稱洗滌，下同）。

　　
2.  加樣

加入待檢樣品（未知抗原）或作適當稀釋的標準參考品于反應孔中，同時作空白孔，陰性和陽性孔對照。37 ℃孵育1 小時，洗滌。

　　
3.  加B-Ab

已作適當稀釋的生物素化抗體（B-Ab），加于每孔0.1 ml，37 ℃孵育30～60 分鐘。洗滌。

　　
4.  加A-HRP

已作適當稀釋的辣根過氧化物酶標記的親和素（A-HRP），于每孔加0.1 ml，37 ℃孵育30～45 分鐘。洗滌4 次。

　　
5.  底物顯色

于上述各反應孔中加入臨時配制的TMB（或OPD）底物應用液0.1 ml，于37 ℃10～30 分鐘。再加2 M H₂SO₄ 0.05 ml以終止反應。

　　
6.  結果判定

目測或在ELISA比色儀上測OD值。

二、檢測未知抗體的BA-ELISA程序

　　　
1.  包被抗原

用0.05 M PH9.6 碳酸鹽緩沖液將已知的抗原作適當稀釋，于聚苯乙烯酶標板的孔中加0.1 ml，4 ℃18-24 小時。用洗滌緩沖液洗3 次，每次3 分鐘。

2.  加樣

加適當稀釋的待檢樣品（未知抗體）于反應孔中，同時作空白、陰性和陽性對照孔。37 ℃孵育1 小時，洗滌。

3.  加B-Ab2

加稀釋過的生物素化抗抗體（抗人或鼠等的IgG），每孔0.1 ml， 37 ℃30-60 分鐘，洗滌。

4.  余下步驟同測未知抗原的BA-ELISA。

1.  反應物的濃度及比例

由于本法敏感性很高，牥括所用抗原或抗體均較ELISA法為少，對生物素標記的抗體（或第二抗體）的濃度更應嚴格掌握，增加抗體濃度可使敏感性提高，但過大又可使非特異性隨之增大。

　　
2.  生物素的穩定性

生物素標記上抗體的結合物，其穩定性均比酶標記抗體為好，宜長期保存，加入等量60 ％甘油于-20 ℃可保存2年左右。保存時切忌反復凍融，反復凍融會使制劑的活性受到損害。

　　
3.  親和素的穩定性

親和素在一般條件下穩定，對熱及多種蛋白質能耐受，但在某些金屬離子存在下對光敏感，容易失活。所以在配制親和素溶液時宜采用無離子水，在4 ℃置2 個月或在-30 ℃置放半年，反復凍融其活性仍保持不變。

　　
4.  親和素的非特異性吸附

親和素在PH中性環境中是帶正電荷的，可通過靜電作用非特異性地吸附到固相載體上，這是引起試驗非特異性顯色的主要原因。如果增加親和素稀釋液的PH和離子強度，均可明顯減少親和素的非特異性吸附，而對特異性顯色也影響不大。也可用戊二醛或醋酸酐對親和素進行化學修飾，使之乙酰化而減少其非特異性吸附。

　　
5.  反應物的作用時間及溫度

由于親和素與生物素之間有很高親和力，故二者標記物反應時間較抗原-抗體反應時間大為縮短。為了減少非特異性吸附，反應時間不宜過長，一般于37 ℃以20-30 分鐘為宜。