樹突細胞的分離實驗

基 本 方 案 1 塑 料 黏 附 和E A 玫 瑰 花結 富 集DC

此種技術用于分離DC已經使用了很多年，其間只經過了微小的修改（Steinman衫aZ.， 1979)

材 料（帶V 項 目 見 附 錄 1)

膠原酶消化的脾臟細胞懸液（見輔助方案）

高密度牛血清白蛋白（BSA) 溶液

R P M I 1640 培 養 基（如 Life Technologies) ， 4℃和 37°C

R P M I - 5 完全培養基， 4°C和 37°C

抗體偶聯的綿羊紅細胞（EA)

用于流式細胞分析的一抗（表 2. 3. 2)

用 于 流 式 細 胞 分 析 的 二 抗（突 光 結 合 的 小 鼠 抗 大 鼠 I g G 和 I g M ; 如 BoehringerMannheim)

Beckman G H -3. 7 和 Sorvall HS-4 轉子

15m l和 50m l聚丙烯錐底管

填充棉花和未填充棉花的高壓滅菌的9in (約23c m ) 巴氏吸管，直 徑 60m m 的組織培 養 皿（如 Falcon)

1 . 將膠原酶消化的脾臟細胞懸液于4°C ， 280 g 離 心 lOmin，棄上清。用 高 密 度 B S A 迅速重懸沉淀物，每個脾臟約lml。

2 . 準 備 B S A 柱 ：將 5 ? 6m l 細 胞 懸 液 加 入 15m l 離 心 管 中 ，在 懸 液 上 小 心 加 入 4°C 1.5m l 的 R P M I -1640培養基，形成一明顯的界面。用 此 種 方 法 準 備 4 或 5 個 B S A柱 ，直至分完細胞懸液。

3 .將 B S A 柱 于 4°C ， 9500 g 離 心 15 min，緩慢加速，注 意 關 掉 「brake」開關。

4 . 小心地用填充棉花的巴氏吸管收集分界面的細胞，吸 走 全 部 的 R P M I -1640和頂部l m l B S A ，將細胞轉移至另一干凈的50m l 離 心 管 中（棄沉淀）。用 4°C 的 R P M I -1640充滿離心管以稀釋B S A ，緩慢搖動混勻。

5.于4°C ， 280 g 離 心 I O m m 后棄上清。重 懸 細 胞 于 5?l O m l R P M I -5完全培養基后置于冰上。

6 . 臺盼藍染色計數活細胞（附 錄 3C ，一個脾臟可得到IO7 個低密度的脾臟細胞）。

7 . 用 R P M I -5完 全 培 養 基 調 整 細 胞 密 度 至 大 約 IO⁷ 個細胞/ml。每 4m l 懸液接種至60m m 培養皿內直至全部細胞鋪板完畢。培 養 90miri使 D C 黏附。

8 . 棄非黏附細胞：用填充棉花的巴氏吸管吸取37°C R P M I -1640培養基，小心清洗培養皿表面，去除懸浮的細胞，直至培養皿表面由粗糙渾濁變為光滑并近乎清亮。重復洗滌一次。

9 . 每個培養皿加入4 ml 37°C R P M I -1640培養基并培養30?60m i n 以去除黏附的淋巴細胞 。重復步驟8。

10.于倒置顯微鏡下利用相差觀察培養皿。可見大部分深色星形樹突細胞、一些明亮扁平的巨噬細胞，以及淋巴細胞、單核細胞之類的圓形細胞。如果樹突細胞比例不高 ，則重復步驟8 、 9。

11.用 4m l 干凈的R P M I -5完全培養基替換每個培養皿中的液體，培 養 12?20 h 。

12.用填充棉花的巴氏吸管吸取37°C R P M I -5完全培養基洗滌平皿。將洗下來的細胞轉移入置于冰上的15m l 離 心 管 中（每 管 可 裝 3 個平皿的洗滌細胞）。用 2m l R P M I -5完全培養基洗滌平皿。重復該操作直到培養皿內的細胞收集完畢。

13.將收集的細胞于4°C ， 280 g 離 心 lOmin，棄上清。用 I m l 干 凈 的 R P M I -5完全培養基重懸細胞后置于冰上。

14.臺盼藍染色計數活細胞（0.5X 10⁶?I.O X l O ⁶ 個細胞/脾 臟 ，約 8 0 % 為 D C )。

15.按每個白細胞5 0 個 E A (抗體偶聯的綿羊紅細胞）的量加入E A (以 結 合 B 細胞和巨噬細胞），顛倒混勻。 4°C ， 70 g 離 心 lOmin。離心后不棄上清，直接將離心管置于冰上30 min。

16.吸棄部分培養基，剩 下 2?2. 5 ml。用填充棉花的巴氏吸管輕微吹打細胞懸液10?1 5 次以吹散大的團塊但是不破壞玫瑰花結。

17.將重懸的細胞用血球計數器檢查以確認是否每個玫瑰花結都是一個白細胞周圍圍繞著紅細胞。如果有必要，再次懸浮細胞。

18.制 備 B S A 柱 ：將 5m l 高密度的B S A 加 入 至 15m l 的離心管中，小 心 地 將 2.5m l 玫瑰花結懸液加到液面上，從而形成一清晰的界面。
19?離心并收集細胞同步驟3?6 (2X 105?7 X 105 個細胞/脾臟 ，大 于 9 5 % 為 D C )。

20.用 表 2. 3. 2 中的抗體標記D C 用流式細胞儀檢測其純度。對于二抗，用熒光結合的小鼠抗大鼠Ig G 和 IgM 。

輔 助 方 案 膠 原 酶 消 化 制 備 脾 臟 細 胞 懸 液

用膠原酶消化的脾臟細胞懸液獲得的D C 數量是用非消化法直接磨損脾臟獲得的2?3 倍（單 元 2.1)。這種方法也能夠松解位于動脈周圍鞘部位的D C 。

材 料（帶V 項 目 見 附 錄 1)

4000U /m l 膠 原 酶 D ，溶化后置于冰上

H B S S ，已滅菌，含 Ca2+ 、 M g 2+ (購置于 LifeTechnologies)

小鼠脾臟

皮下注射針， 22 G X l M i n 內 徑（BectonDickinson)

10m l 、 5m l —次 性 注 射 器（如 Becton Dickinson)

IOOmm直 徑 培 養 皿（如 Falcon)

2 個高壓滅菌的鋸齒狀解剖鑷（如 Roboz)

高壓滅菌的不銹鋼網.?將4 0 目的不銹鋼網剪成5c m X 5c m 的小方格，向下折疊邊緣 ，然后將四邊彎成淺的矩形碗；錫箔紙包裹后高壓滅菌。

1.將2 管 I m l 的 4000U /m l 膠 原 酶 D 稀 釋（足夠用于2 0 個脾臟）： Im l 加 入 9m l H B S S(稀 釋 至 400U /m l ，步 驟 8 使用）， I m l 加 入 39m l 的 H B S S (稀 釋 至 100U /ml)。置
于冰上。

2 . 將 22 G 針頭連接在I O m l 的注射器上，充 滿 l O O U / m l 的膠原酶。將 I O m l 的 l O O U / m l溶 液 加 人 I O O m m 的培養皿中。

3 . 取另外一個直徑I O O m m 的培養皿進行操作。一只手拿鑷子，另一只手拿注射器，拇
指放在活塞上。用 鑷 子 夾 住 小 鼠 脾 臟 ，用 針 頭 刺 入 脾 臟 被 膜 的 狹 窄 邊 緣 ，注入100U /m l 膠 原 酶 100/xl。用鑷子將脾臟推向針頭，使針頭前進幾毫米。重復注射膠原酶 ，繼續直到I m l 膠原酶都注射入脾臟，針頭從另一端刺穿脾臟。

4 . 用針頭撕開脾臟，將其轉移至含膠原酶的培養皿中（步 驟 2)。重復操作，直到所有脾臟都注射和撕開。

5 . 從第二個培養皿中收集細胞懸液加入到置于冰上的50m l 離心管中。用 3m l l 00U/ml的膠原酶漂洗培養皿后加到上述50m l 離心管中。

6 . 加 入 3ml l 00U /m l 膠原酶至培養皿中。將撕碎的脾臟依次轉移至培養皿。用 2 個鑷子將它們撕成邊長I m m 的小碎塊，使其能通過5m l 吸管的內徑。當所有的脾臟都撕碎 后 ，將先前放置脾臟碎塊的培養皿中的膠原酶溶液加入進來，用 5m l 吸管猛烈吹打多次。

7 . 傾斜培養皿，將大塊碎片除開，將細胞懸液轉移至第5 步的置于冰上的50m l 離心管中。用幾毫升lOOU/m l 的膠原酶洗滌培養皿后加入至離心管中。

8 . 在培養皿留下的脾臟碎塊中加入IOml 400U /m l 的膠原酶。吹打數次后于培養箱里放置 30?90 min。

9 . 在孵育的最后階段，猛烈吹打碎片， 將其吸至直徑I O O m m 培養皿的無菌鋼網上。

10.用鑷子固定鋼網一端，用 幾 毫 升 lOOU/m l 膠原酶洗滌碎塊，然 后 用 無 菌 的 5m l 注射器活塞碾磨碎塊。搗爛直到所有的紅色物質從組織中去除。再用幾毫升lOOU/ml膠原酶洗滌鋼網。

11.將鋼網從培養皿中拿開，丟棄無色的黏附的被膜碎塊。猛烈的吹打培養皿中的液體 ，將其轉移至步驟7 的 50m l 離心管里。用 幾 毫 升 l O O U / m l 膠原酶洗滌培養皿后一同加入到離心管中（約 有 0 . 5 % 為樹突細胞或者更少）。

12.如果需要，即可用高密度的B S A 離 心（見基本方案1)。

基 本 方 案 2 用 小 鼠 骨 髓 前 體 細 胞 培 養 樹 突 細 胞（DC)

此 方 法（Inaba ， 1 9 9 2 ) 克 服 了 組 織 中 可 利 用 的 「內 源 性 A P C 」數量的有限性 。 一 旦培養成功，大量 的 D C 可用作細胞生物學的研究、遺傳性狀修飾、體內免疫。此種方法在研究D C 分化的生物學中也非常重要。

材 料（

6?7 周 齡 小 鼠（最好為雄性鼠，因為它們的骨頭比較粗大；運輸后需要休息至少5天 ；不要使用應激或脫水的老鼠）

7 0 % 乙醇

冰冷的以及室溫的R P M I -1640培 養 基（如 Life Technologies)

氯化銨溶液 〇? 02mol/L Tris ? C U p H 7. 2 (附錄I) /0?14mol/L N H 4Cl

裂 解 淋 巴 細 胞 的 抗 體（雜交瘤上清）（可選）。例 如 ，雜 交 瘤 R A 3-3A 1 (B 2 2 0 抗體 ； A T C C 號 TIB146)、 G K 1.5 (C D 4 抗 體 ； A T C C 號 Tffi 207)、 3.155
(C D 8 抗 體 ； A T C C 號 TIB211)、 M 5/114 ( M H C I I 抗 體 ； A T C C 號TIB1 2 0 ) —見 單 元 1. 3

兔 補 體（Pel-Freez)

R P M I -5完全培養基

小鼠G M - C S F (m G M -C S F ) : 可以來源于純化的重組蛋白，也可來源于轉染小鼠G M - C S F 基 因 的 細 胞 系 的 條 件 培 養 基（瑞 士 巴 塞 爾 A . Lanzavecchia博士贈送）

用 于 流 式 細 胞 檢 測 D C 的 抗 體 ：如 M H C I I 類 分 子 的 雜 交 瘤 上 清（A T C C 號TIB120)、 B 7-2/C D 86 的 雜 交 瘤 上 清（Pharmingen)、 D E C -205 的 抗 體( A T C C 號 H B 290)

解剖用品

無菌紗布墊

I O O m m 培 養 皿（如 Falcon)

3 ml 注射器 25 G ， 5/8in (1.58c m ) 針頭

9in (23c m ) 巴 氏 吸 管（填充棉花并高壓滅菌）

Nytex 濾 器（3-40/26; Tetko)

15m l 和 50m l 聚丙烯錐底管

2 4 孔 培 養 板（如 Corning)

1 . 取小鼠股骨和脛骨，保存在置于冰上的R P M I -1640培養基中，直到所有的小鼠準備完畢。去除骨頭上的肌肉（通常在無菌紗布墊上操作）后 ，將干凈的骨頭置于新的平皿里。然 后 在 含 7 0 % 乙醇的培養皿里浸泡骨頭2 min，最 后 用 冷 R P M I -1640培養基 洗 滌 2 遍 。

2 . 用 剪 刀 減 去 骨 的 兩 端（骺）然后將其轉移到另外的培養皿中。用 注 射 器 吸 取 2 mlR P M I -1640培養基沖洗骨髓腔以獲得骨髓。在另一培養皿里剁碎骨骺。將剁碎的骨骺以及從骨髓腔里沖洗出來的骨髓混合在一起，用吸管打碎團塊，將懸液通過篩網(去除顆粒）后 收 于 15m l 或 者 50m l 的離心管里。

3.加入3?I Oml 的氯化銨溶液裂解紅細胞。室溫靜置3m i n 后 ，室溫， 280 g離心IOmin(1200r/min Beckman G H -3. 7 轉子），棄上清。

4 . 去 除 淋 巴 細 胞（可選）：將細胞配成I X l O ⁷ 個細胞/m l ，加入合適濃度的雜交瘤上清(通常1 : 2 0 終濃度）和 兔 補 體（通 常 1 : 17?1 : 2 0 終濃度）。 37°C 水浴培養lh，每
20m i n 振蕩一次。

作者 用 了 B 220抗 體（雜交瘤R A 3-3A 1)、 C D 4 抗 體（雜 交 瘤 G K 1. 5)、 C D 8 抗體（雜交瘤3.155)和1MCHII抗 體（雜交瘤M5/114)。

5 . 用 R P M I -1640洗 滌 骨 髓 細 胞 2 次 ，室 溫 ， 280 g 離 心 l O min。 計 數 活 細 胞（附錄3 0 。 用 R P M I -5完全培養基調整細胞濃度至I X l O ⁶ 個細胞/m l 。

6 . 加入小鼠重組G M -C S F 至終濃度為700?lOOOU/m l 或 者 20ng/ml。將細胞懸液一般每只小鼠可以得到4 X 10⁷?5 X 10⁷ 個 骨 髓 細 胞（沒有去除淋巴細胞）按 Iml/孔接種
2 4 孔板。

7.每兩天洗滌細胞一次，每次移出舊的培養基，然 后 傾 斜 2 4 孔 板 用 R P M I -1640輕輕地沿孔壁洗滌細胞后吸出洗滌液，最 后 加 入 I m l 新 的 含 700?lOOOU/ml (約 20ng/ml) m G M - C S F 的 R P M I -5完 全 培 養 基（步 驟 6)。

8.可選：驗證聚集物的特征—M H C II類分子存在于不成熟 D C 的 胞 內 小 室（M H CII小室或者MIIC) 通 過 標 記 [3 H ] 胸腺嘧啶，可 發 現 1 0 % ?2 0 % 的細胞處于S 期 ，用 流 式 細 胞 儀（單 元 4,1和單 元 4. 2 ) 分析，細胞中度表達膜M H C II類分子，但是
不 表 達 B 7-2/C D 8 6 共刺激分子。到 第 6 天 ， 培 養 板 孔 中 布 滿 很 多 聚 集 體 或 者 球 形 的 處 于 增 殖 期 的 非 成 熟 D C 。

9.在 第 5?8 天 期 間（此時已產生足夠的聚集體），用 R P M I -1640或 R P M I -5培養基輕輕吹打，將聚集體從貼壁的基質細胞上脫離下來（此后幾天一直會有聚集體產生）。收集脫離的細胞，室溫， 280 g 離 心 lOmin，棄上清。用 R P M I -5培養基重懸，最高
濃 度 為 I X l O ⁶ 個細胞/ml。然后鋪在直徑為I O O m m 的培養皿中，每 個 培 養 皿 10m l ，最 多 鋪 I X l O⁷個細胞。

10.于細胞轉移后24?48 h 期間 ，每 24 h 輕輕搖晃培養皿，收集非貼壁、非增殖、成熟的 D C ，轉移至另外的收集管中用于后期的研究。

11.計 數 活 細 胞（附 錄 3 0 。用 流 式 細 胞 儀（單 元 4 . 1 和 單 元 4. 2 ) 或者用血球計數板(附錄3C ) 計 數 大 的 形 狀 不 規 則 的 細 胞 來 檢 測 D C 得 率 （每 只 動 物 通 常 獲 得 5 X
IO⁶?IOXlO⁶個細胞，> 6 0 % 表達成熟D C 的表面標志）。