核磁共振波譜在藥物分析中的應用，字數越多越好

核磁共振譜峰的面積(積分高度) 正比于相應質子數, 這不僅用于結構的分析中, 同
樣可用于定量分析. 用NMR 定量分析的最大優點, 是不需要引進任何校正因子或繪制工
作曲線, NMR 可以用于多組分混合物分析、元素(如H、F) 的分析、有機物中活潑氫
及重氫試劑的分析等. 其中, 混合物的定量分析更是廣泛應用到各個領域, 如: 最早的藥
物APC 藥劑中阿斯匹靈、非那西汀、咖啡因的含量分析; 有機合成中復雜產物和副產物
的組成分析; 對于元素分析而言, 若儀器的積分裝置精密度較高, 則氫含量的測定甚至比
元素分析(燃燒法) 更為精確, 又有全部回收樣品的優點. NMR 定量分析的方法分為內
標法和外標法, 內標法準確性更好, 操作更方便. 用這兩種方法也可以間接求出物質的分
子量.
藥物被人體吸收進入血液后會與在血清中的生物分子（如脂蛋白與白蛋白等）相互作用，形成分子配合物。而這種結合的效率和穩定性嚴重影響藥物的分布、轉運、藥效、毒性和代謝。闡述藥物與血清中生物分子的結合特性及其與藥物分子結構的關系，無論對于探索生命體系中的生物物理過程和化學過程，還是新藥開發和藥理學研究都具有重要的意義。本項成果的主要工作是發展了一系列適用于生物樣品分析的液體高分辨核磁共振（NMR）新技術，并應用發展的技術研究了藥物與血液中生物分子的相互作用中的一些基本問題，如藥物布洛芬抗血脂蛋白氧化機理的研究等。本工作拓展了液體高分辨NMR在生物樣品分析中的應用范圍，在用磁共振波譜分析方法直接研究生物體系的組成、生物分子間的相互作用和動力學過程及其影響因素等研究中取得了一批具有重要理論意義和應用價值的成果。這些成果作為杰出青年科學基金的主要內容，在基金委組織的結題驗收中被評為優秀。

1、建立了一系列用于研究血液中生物分子的擴散、弛豫等動力學特性測定、以及生物分子NMR譜表征和分子間相互作用的波譜學新方法
從理論上講，核磁共振(NMR)參數包含著豐富的分子結構、相互作用、動力學性質等信息。但是，在體溫條件下，直接測定血液（清）中生物分子的NMR參數，進而用于研究藥物與其相互作用，需要克服NMR譜峰重疊、熱對流、水峰抑制等困難。

建立了用于在較高溫度下準確測定生物樣品中分子自擴散系數的雙重雙向梯度場多重回波實驗方法（DMSE）：生物分子的運動行為（可用其擴散系數表征）與其所處的環境、狀態和分子間的相互作用密切相關，在體溫條件下測定的擴散系數更能反應生物分子的本征特性。但是，當樣品溫度超過室溫時，熱對流的存在會影響擴散系數的準確測定。我們提出的DMSE方法能夠有效地消除熱對流和背景梯度場對分子自擴散系數測量的影響。理論和實驗結果都表明，在?50?C的溫度下該方法能夠可靠測定生物樣品中分子自擴散系數(Clark et al, Rapid Commun Mass Sp 16(15) 2002; Shapiro et al, JACS 124 2003; Perez-Mendez et al, Macromolecules 36(21) 2003)。此外DMSE方法還具有NMR譜編輯的功能(Lucas et al, Anal Chem 75(93) 2003; de Graaf et al, Anal Chem 75(9) 2003)，可以用于區分和選擇性檢測生物樣品（如血清）中蛋白質等大分子與小分子代謝物的NMR譜，研究大分子和小分子之間的相互作用。(Anal. Chem. 2001, 73: 3528-3534)。
b). 與溶劑峰具有相同和相近化學位移的信號峰的恢復方法（RECUR）：生物樣品都以水為溶劑，其中水質子的濃度比樣品的濃度高約5個數量級。因此，生物NMR研究首先需要抑制溶劑（水）峰。但是，在溶劑峰被抑制后，與溶劑峰具有相同或相近化學位移的其它物質的共振峰也會被抑制，相應的信息將隨之消失。我們提出的RECUR方法通過極化轉移的原理將與溶劑峰具有相同或相近化學位移的其它物質的共振峰高效率地恢復。該方法還能同時實現分子內和分子間的極化轉移。利用該方法可以觀測血清樣品中蛋白質上結合水的信號，并能測定與水具有相近化學位移的共振信號的弛豫時間。(J. Magn. Reson., 2001, 153: 133-137)。
c). 發展了用二維最高量子相關譜測量生物分子T1弛豫時間和J偶合常數的方法：生物分子中原子核自旋的弛豫時間包含著豐富的分子結構、動力學、以及分子間相互作用等重要信息。雖然測定縱向弛豫時間的一維NMR方法很多，但是都不適用于共振峰嚴重重疊的生物樣品。我們根據最高量子相干法（MAXY）能夠區分和編輯不同類型的質子（甲基、亞甲基和次亞甲基）的共振峰的特點，建立了用二維最高量子相關譜測量核自旋縱向弛豫時間和多量子偶合常數分解譜的新方法，并將該方法應用于了膽固醇類分子中各種質子的弛豫時間的測定以及丙氨酸甲基的四個多量子相干態的縱向弛豫時間的同時或選擇性測定。(J. Magn. Reson., 2000, 146: 277-282；Mol Phys. 2001, 99: 1701-1707)。

2、人血清中脂蛋白的NMR表征與測定
人血清白蛋白（HSA）和脂蛋白是人血清中大量存在的可與藥物相互作用的生物分子。血清脂蛋白是由血清脂質和載脂蛋白組成的水溶性的生物分子顆粒，根據其密度的不同可細分為高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和非常低密度脂蛋白(VLDL)等。血脂和脂蛋白代謝異常與動脈粥樣硬化關系密切。研究表明，動脈粥樣硬化的發病率與血液LDL水平，特別是氧化的LDL (Oxidized LDL, ox-LDL)水平呈明顯的正相關，與HDL水平呈負相關。準確測定人血清中各類脂蛋白的含量對動脈粥樣硬化的診斷和防治具有重要意義。目前還沒有一種快速簡便的能夠對各類蛋白質進行同時測定的方法。通過物理或化學方法分離脂蛋白費時且價格昂貴。我們發展了在不進行任何物理和化學分離的條件下，以擴散加權NMR為手段定量分離、分析血清中各種脂蛋白的新方法。該方法以甲基(?0.8~?1.0)和亞甲基(?1.2~?1.5)的共振峰為特征峰，結合譜峰擬合技術，可得到血清中不同組分的NMR子（亞）譜。測定這些子譜（組份）在不同梯度場強度下的衰減，發現它們明顯可分為4類，即HDL、LDL、HSA和VLDL。從信號的衰減速度可以計算出各種蛋白的自擴散系數。各個組份NMR峰的面積與其在血清中的含量成正比關系，擴散系數的大小與其動力學性質有關，從而達到表征血清脂蛋白的目的，為血清蛋白質的全分析以及研究藥物與脂蛋白的相互作用打下了基礎。本研究成果的論文應邀發表在Magnetic Resonance in Chemistry 2002, 40, S83-S88,特輯。

3、藥物布洛芬（IBP）抗血脂蛋白氧化的機理研究
最新研究表明藥物（IBP）具有抗血脂蛋白氧化的作用，在治療血管粥樣硬化上具有潛在用途。但目前IBP抗氧化作用的機理還不明確。我們應用擴散加權核磁共振波譜方法再沒有任何物理分離的條件下，研究了IBP在血清中與脂蛋白的相互作用。結果表明在血清中加入IBP后：1）脂蛋白顆粒中不飽和脂分子中烯鍵及其相鄰基團上的質子的化學位移發生變化，表明IBP與脂蛋白中的不飽和脂發生了親脂性相互作用；2) 脂蛋白顆粒中的鞘磷脂(SM)和卵磷脂(PC)的極性基團-N+(CH3)3的化學位移發生變化，可能是由IBP的羧基(-COO-)與-N+(CH3)3發生親電性相互作用而引起的，鞘磷脂的作用強度大于卵磷脂；基于這些實驗結果，我們推測布洛芬的抗氧化作用可能機理是：布洛芬被結合到脂蛋白顆粒表面富不飽和脂的部位，保護不飽和脂不被自由基攻擊，從而起到抗氧化作用。(Anal. Biochem. 2004, 324, 292-297)。

4、藥物IBP與血清中生物分子相互作用的動力學特性研究
藥物IBP在進入血液后，它不僅僅與脂蛋白相互作用結合，還有可能與其它藥物或者體內其它的蛋白（如HSA）結合。為了研究IBP與HSA的結合對IBP抗血脂蛋白氧化功效的影響以及在兩種或以上藥物同時存在時IBP與HSA的相互作用，我們研究了IBP、水楊酸(SAL)和HSA組成的三元體系中IBP與蛋白間的相互作用。結果表明IBP和SAL在HSA上不僅具有各自特征的結合點，還具有相同的結合位點（共同結合點）；兩種藥物與HAS的結合既存在共結合，也存在競爭結合。（J. Pharmceut. Biomed. Anal., 2004, 34:247）
在實驗結果的基礎上，我們建立了用于描述藥物與蛋白相互作的競爭結合模型，并根據這個模型得到了兩種配體（IBP和SAL）與白蛋白結合的離解常數以及二者在蛋白上總共的結合點數。我們還用托美丁、SAL和HSA的三元體系驗證了這個模型，得到了這兩種藥物在白蛋白上的特征結合位點數和共有結合位點數。（J. Pharmceut. Biomed. Anal., in press）。