核糖核酸酶H（RNase H）最早是從小牛胸腺組織中發現的，其編碼基因已被克隆到大腸桿菌中。它能特異地降解DNA：RNA雜交雙鏈中的RNA鏈，產生具有3’一OH和5’一磷酸末端的寡核苷酸和單核苷酸，它不能降解單鏈或雙鏈的DNA或RNA。
在分子克隆中，核糖核酸酶H的主要用途是與大腸桿菌DNA聚合酶工和DNA連接酶一起參加cDNA克隆中第二條I）NA互補鏈的合成。當用逆轉錄酶以mRNA為模板合成cDNA第一鏈之后，用RNase H部分消化mRNA：DNA雜交分子中的RNA，產生的RNA片段就像岡崎片段一樣，作為大腸桿菌DNA聚合酶T的引物，以cDNA第一鏈為模板合成DNA，直到把mRNA全部代替。然后在DNA連接酶的作用下，封閉缺口形成雙鏈cDNA。