實驗材料
| 試劑、試劑盒 | |
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| 實驗步驟 | ( 1 ) 按照 Morre 和 Anderson 的方法從水稻懸浮細胞中分離細胞核，本文對方法進行了一些改動。所有分離細胞核的步驟都在冰上或 4°C 進行。 ( 2 ) 3000 g 離心 5 min 收集約 3 g 水稻懸浮細胞并重懸于 5 ml 冰浴預冷的 PBS 中。懸浮液再次用 3000 g 離 心 5 min。沉淀用 5 ml 勻漿液重懸后轉移至玻璃研缽中并研磨成勻漿。 ( 3 ) 勻漿用雙層 Miracloth ( Calbiochem、Darmstadt、Germany) 過濾兩次。 ( 4 ) 轉移勻漿至 15 ml falcon 管中并用 1000 g 離心 10 min。 ( 5 ) 輕輕地用勻漿液重懸沉淀并置于 2.0 mol/L 蔗糖梯度頂端，然后在 4°C 條件下 50000 g 離心 30 min。蔗糖梯度包含 37.5 mmol/L Tris-馬來酸（pH 6.5 ) 、5 mmol/L MgCl2 和 1% 糊精 T500。 ( 6 ) 小心地除去上清液，沉淀再次輕輕地用 5 ml 勻漿液重懸。 ( 7 ) 再次將重懸液置于 2.0 mol/L 蔗糖梯度頂端并用 50000 g 離心 30 min。將含有細胞核的沉淀重懸于 100 μl 勻漿液中并用光學顯微鏡觀察。（ 圖 9-1A ) 。 ( 8 ) 含有細胞核的懸浮液被用來提取核蛋白。可以用裂解緩沖液提取用于雙向電泳的蛋白質樣品，或用 SDS 樣品緩沖液提取用于 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳的蛋白質樣品。每 20 μl 懸浮液中的細胞核可用 500 μl 裂解緩沖液或 SDS 樣品緩沖液在玻璃勻漿機中溶解。  ( 9 ) 核蛋白的純度通過使用抗組蛋白 H1 抗體的 Western 雜交分析來檢測（SantaCruz Biotechnology， Santa Cruz, CA) (圖 9-1B) 。 ( 10 ) 利用雙向電泳分離用裂解緩沖液從純化后的細胞核中提取的蛋白質 ( 500 μg ) 。（圖 9 - 2 , 見注釋 1)。   |