| 實驗步驟 |
一材料與設備
1)cDNA
2)PBS
3)NP-40 裂解緩：0.5%NP-40,10mmol/LTris-HCl(pH7.4)，3 mmol/LMgCl2,10 mmol/LNaCl
4)20XSSC:3mol/LNaCl,0.3mol/L 檸檬酸鈉 (pH7)。
5)1mol/LNaOH
6) 甘油儲存緩沖液：40% 甘油，50 mmol/L Tris-HCl (pH8.3) 0.5 mmol/L MgCl2, 0.lmmol/L EDTA
7)10X 轉錄緩沖液：l00 mmol/LTris-HCl(pH7.5)，50 mmoI/LMgCl2，800 mmol/LKCllmmol/LEDTA,5 mmol/LDTT
8) 核苷酸:ATP,GTP，CTP
9)200uCi「α32P]-UTP:3000Ci/nmol。
10)10XSET;5%SDS，50 mmol/LEDTA，50 mmol/LTris-HCl(pH7,4)
11) 蛋占酶 K
12) 無 RNase 的 DNase:1Omg/mL
13)CaCI2：20 mmol/L
14) 硫氰酸胍溶液:4mol/L 硫氰酸胍，25 mmol/h 檸檬酸鈉 (PH7.0),0.5%Sa rcosyl0.lmol/L2-疏基乙醇
15)Tris-SDS 緩沖液：Tris-HCl(PH7.2),1 mmol/LEDTA,0.1%SDS
16) 水飽和酚
17) 氯仿：異戊醇 (49:1)
18)0.45um 硝酸纖維素/尼龍膜，
19) 無水乙醇。
20) 異丙醇。
21) 酵母 tRNA:10 mg/ml。
22) 乙酸鈉：2mol/L
23) 紫外交聯儀 D
24) 狹縫印跡裝
25) 雜交箱。
二、操作方法
下面每一步均在 0-4°C 進行
1）用冷的 PBS 洗 1X107-5X107 個細胞，1500 g 離心 5 min 收集細胞。
2) 去除上清，重懸細胞于 PBS 中，1500 g 離心 5 min 收集細胞。
3) 去除上清，加入 4 mlNP-40 裂解液，溫和渦漩振蕩, 冰上放置 10 min
4) 于 4℃,400 g 離心 10 min 沉淀細胞核。用 NP-40 裂解液洗滌一次.
5) 用 200ul 甘油緩沖液重懸沉淀，在顯微鏡下觀察細胞裂解情況。
6) 分裝，凍存于液氮中。
(二）核轉錄
1) 在無菌離心管中加入：3X107 個細胞核，35% 甘油，20ul1OX 轉錄緩沖液，4 mmol/LATP，GTP，CTP,200uCi(α32P]-UTP, 加蒸餾水至 200ul 于 26°C 溫育 10 min
2) 加入 10ul_DNase1，10ul20 mmol/LCaCl2，于 26℃ 溫育 lOmin，酶切核 DNA。
3) 加入 2ul 蛋白酶 K,25ul10×SET,5ul 酵母 tRNA，于 37℃ 溫育 30 min。
4) 加入 550ul 硫氰酸胍溶液，90ul2mol/LNaAc，900ull 水飽和酚，180ul 氯仿/異戊醇，置于冰上 15 min。
5) 于 4℃,12000 g 離心 15 mm, 吸出水相。
6) 加入等體積異丙醇，一 20℃ 沉淀 1-2 h。
7) 于 4℃12000 g 離心 15mim 用 300ul 硫氰酸胍溶液溶解沉淀，
8) 加入等體積異丙醇，一 20℃ 沉淀 1-2 h,
9) 與 4℃12OOOg 離心 15mim, 用 70% 乙醇洗滌沉淀，用 1 mlTris-SDS 緩沖液溶解沉淀。總活性為 1X107-2X107cpm。
(三) 雜交分析
1) 在 100ul 的 25ug cDNA 探針或 50ug 線性質粒中加入 10% 體積的 lmol/LNaOH，使之變性。
2) 溫育 15 min, 用 10 倍體積 6XSSC 中和。
3) 剪裁大小合適的硝酸纖維素/尼龍膜。用 0.4mol/LTris(PH7.0) 溶液將膜浸泡30 min, 而后將膜置于狹縫印跡裝置上。
4) 將 1-5ug DNA 加至膜上，真空狀態下于 80℃ 烘烤 2 h 或紫外交聯 2 min。
5) 按常規方法進行預雜交，雜交。
6)X 射線片，顯影分析。
展開
|
