核酸凝膠電泳3

3、電泳：電壓＜10V/cm，電泳至溴酚蘭移出樣品槽到凝膠板的2/3距離時，關閉電源。
4、取出凝膠塊，置紫外透射反射分析儀上觀察，即可見桔紅的DNA區帶。
【注意事項】
1、加樣時槍頭不要碰壞孔壁，否則DNA帶型不整齊。大多情況下，加樣時不必更換槍頭，可在陰極槽中反復吸打電泳緩沖液清洗，但對Southern印跡轉移和需回收DNA時，應每個樣品使用新的槍頭，以避免樣品交叉污染。
2、上樣緩沖液不僅提高樣品的密度，使樣品均勻沉到樣孔底，還使樣品帶色，便于上樣，估計電泳時間和判斷電泳位置。

3、EB是一種強烈誘變劑并有中度毒性，應戴手套操作，對于含有EB的溶液也不應直接倒下水道，用后妥善凈化處理：EB含量大于0.5μg/ml溶液先用水將EB濃度稀釋至0.5μg/ml以下，每100ml溶液加入100mg活性碳，不時輕輕搖蕩混勻，室溫放置1小時，濾紙過濾將活性碳與濾紙密封在塑料袋中作為有害廢物丟棄。或用專用一次性染料清除袋（Gene有限公司）吸附過夜，再焚燒袋子即可。
4、應在暗箱窗口觀察結果，避免紫外線操作者的損傷。
5、電泳過程中，EB向陰極移動（與DNA相反），延長電泳時間，EB會從凝膠中遷移出來，從而使小片段DNA難于檢測，可將凝膠浸在0.5μg/ml EB溶液中重新染色后檢測。
6、加樣孔的加樣量依DNA樣品中片段的數量及大小而定，通常對0.5cm寬的加樣孔，DNA上樣量在0.1~0.5μg即可有良好的觀察效果。如樣品為酶切產物（由大小不同的DNA片段組成），每孔加20~30μg DNA也不致明顯影響分辨率。

7、小的凝膠——微型凝膠和中型凝膠的電泳一般比大的凝膠要快，常常用于快速分析。當選擇微型或中型凝膠裝置時要考慮凝膠槽盛裝緩沖液的體積，小膠通常要在高壓下電泳（>10V/cm），所以選擇一個相對較大的緩沖液槽比較有利。
四、聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）
聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylamide gel PAG）是通過丙烯酰胺（Acr）和交聯劑甲叉雙丙酰胺（Bis）在一個適當的自由基催化的作用下共聚合而成的高分子多孔化合物。常用聚合方法有化學聚合和光聚合兩種。化學聚合的催化劑通常采用過硫酸銨（AP），此外，還需要一種脂肪族叔胺作為加速劑，常用的加速劑為四甲基乙二胺（TEMED）。PAG網孔大小與丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰銨的濃度有關。此外，凝膠的機械性、彈性、透明度、粘著度等也與Acr和Bis的比例有關。一般根據分離的DNA分子量大小選擇適當凝膠范圍。
PAG常規灌制于兩塊封閉的平板之間，進行垂直電泳，其制備及電泳都比瓊脂糖凝膠更費事，但相比之下具有以下優點：①分辨率很強，相差1bp的DNA分子即可分開；②樣品槽裝載DNA量大，多達10μg DNA而不明顯影響分辨力；③回收DNA純度提高，可適于最高要求的實驗；④無色透明，紫外線吸收低，抗腐蝕性強，機械強度高，韌性好。
常用的是兩種PAG：
1、用于分離和純化雙鏈DNA片段的非變性PAG；
2、用于分離和純化單鏈DNA片段的變性PAG。
方案一 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳
【原 理】
非變性聚丙烯酰胺凝膠，用于分離和純化小分子雙鏈DNA片段（<1000bp），大多雙鏈DNA在此膠中的遷移率大略與其大小的對數值成反比，但遷移率也受堿基組成和序列的影響，同等大小的DNA分子可能由于空間結構的不同而遷移率相差10%，故不能用它來確定雙鏈DNA的大小。
【試劑及配制】
1、30%丙烯酰胺
丙烯酰胺 29g
N，N'-——甲叉雙丙烯酰胺 1g
加水到100ml，加熱至37℃溶解，室溫避光保存，貯存期間檢查溶液的pH值≤7.0。
2、5×TBE（pH8.3）
Tris堿 54 g
硼酸 27.5 g
0.5mol/L EDTA(pH8.0) 20 ml，加水定容至1L。
3、10%過硫酸銨（AP）： AP 1g 加水定容到10ml，4℃下可貯存數周。
4、TEMED
5、DNA分子量標準
6、6×凝膠加樣緩沖液
0.25% 溴酚藍
0.25% 二甲苯青FF
30% 甘油
【操作步驟】
1、用洗滌劑浸泡玻璃板、填條和梳子，必要時用KOH/甲醇清洗（100ml甲醇加5g KOH配制），水洗后再用乙醇淋洗。每塊玻璃板的一面都用聚硅氧烷溶液處理，以防凝膠與玻片貼緊并減少電泳完畢后卸膠時凝膠破裂的可能性。
2、裝好灌膠用的玻璃片及填條，用瓊脂糖封好底、左、右三邊。
3、依所分離的DNA的大小來確定合適的凝膠的濃度，參見表：

制備聚丙烯酰胺凝膠所用試劑的體積

4、每100ml膠液中加入35μl TEMED，迅速混勻，用注射器注入膠床，插入梳子，應密切注意膠內不要有氣泡，檢查有無凝膠滲漏。