核酸檢測實驗室如何評價熒光定量PCR儀!

　　熒光定量PCR的檢測是一系列從采樣、保存運輸、樣品處理、核酸提取、擴增等一系列流程的組合，任何一個環節出現問題都會導致最終結果的錯誤。雖然在前面一系列的文章中講述了提取試劑、擴增試劑的評價但是這些仍遠遠不夠，因此我在后續的文章中會盡可能覆蓋到所有的檢測環節。

　　熒光定量PCR的檢測離不開熒光定量PCR試劑和熒光定量PCR儀器。試劑的評價前面已經講了（診斷試劑評價系列2-核酸檢測方法（更正））。但是每次提到熒光定量PCR儀的評價，大家總是望而卻步。一方面原因是熒光定量PCR儀涉及很多溫度、光電信號需要專業的設備來評估，另一方面也確實不知道從哪里入手。今天我們梳理下在核酸檢測實驗室中如何通過試驗來評價熒光定量PCR儀。

　　一、熒光定量PCR儀的物理性能試驗相關指標

　　通過物理方法測定PCR性能的試驗。主要包括測定溫度和熒光來進行評價，由于需要專業的設備，建議聯系計量部門或儀器廠家進行相關指標的測定。

　　最大升溫速率：

　　50℃-90℃應不小于2.5℃/秒。

　　平均升溫速率：

　　50℃-90℃應不小于1.5℃/秒。

　　最大降溫速率：

　　90℃-50℃應不小于2.0℃/秒。

　　平均降溫速率：

　　90℃-50℃應不小于1.5℃/秒。

　　模塊控溫精度：

　　應不大于0.5℃。

　　溫度準確度：

　　測定值與設定值應不超過±0.5℃。

　　模塊溫度均勻性：

　　溫度差值在±1℃范圍內。

　　溫度持續時間準確度：

　　溫度持續時間與設定溫度時間偏差在±5%以內。

　　熱蓋溫度偏差：

　　溫度差值在±3℃范圍內。

　　熒光強度檢測重復性：

　　高中低濃度校準染料重復測定的變異系數不大于3%。

　　熒光強度檢測精密度

　　隨機選取10個及以上個檢測孔，用高中低濃度校準染料進行檢測，變異系數不大于5%。

　　不同通道熒光干擾

　　其他通道熒光檢測強度不高于目標通道熒光閾值。

　　二、熒光定量PCR儀的生物化學試驗相關指標

　　對溫度敏感的PCR反應對PCR儀進行生化性能試驗。該指標可以通過熒光定量PCR的試驗對儀器進行評價，每個核酸檢測實驗室都可以開展的評價試驗。

　　樣本檢測重復性

　　對高中低濃度核酸樣品進行檢測，Ct值變異系數不大于3%。

　　樣本線性

　　對系列稀釋梯度濃度的樣品（至少5個梯度）進行檢測，回歸系數R不低于0.99。

　　熒光線性

　　對系列稀釋熒光染料（至少5個梯度）進行檢測，回歸系數R不低于0.99。

　　三、熒光定量PCR儀評價的試驗設計

　　1.試驗準備

　　1.1有證標準物質

　　國內外有證標準物質，標準物質類型為質粒DNA或RNA。不推薦使用自制沒有進行定量的質控品。

　　1.2熒光染料

　　可以選用試劑盒自帶的ROX染料或購買標準熒光染料。

　　1.3.熒光定量PCR方法

　　需要使用經過驗證過的熒光定量方法：擴增效率90%-110%（越接近100%越好）；R2大于0.99；最低檢測限應低于10 copies/反應。

　　1.4.反應體系

　　質量高口碑好的反應體系。

　　1.5.耗材

　　儀器推薦使用的專用于熒光定量PCR的耗材。

　　1.6.熒光定量PCR反應條件

　　常規熒光定量PCR反應條件，普通模式，40個循環。不建議使用快速模式和預擴增反應條件。

　　2.重復性試驗

　　選擇高中低濃度標準物質進行檢測（推薦濃度為5000 copies/反應、500 copies/反應和50 copies/反應），每個濃度至少5次重復，樣品管隨機放置在反應板中心和邊緣的不同位置 。Ct值變異系數不大于3%。

　　3.樣本線性試驗

　　對已知濃度的樣品進行5倍或10倍梯度稀釋（至少5個梯度），每一濃度梯度平行測試3孔，Ct均值的回歸系數R不低于0.99。

　　4.熒光線性試驗

　　對已知濃度的標準熒光染料進行梯度稀釋（至少5個梯度），每一濃度梯度平行測試3孔，回歸系數R不低于0.99。

　　5.不同熒光通道干擾試驗

　　如果檢測中使用雙重或多重熒光檢測，可設計如用FAM探針擴增用VIC通道檢測，檢測結果不應該有高于閾值線的熒光信號。

　　總結：熒光定量PCR儀的評價需要結合物理性能（溫度和熒光）和生化性能（熒光定量PCR反應）才能獲得儀器總體的表現。但是核酸檢測實驗室日常使用已知濃度的有證標準物質定期對熒光定量PCR儀進行評價也至關重要。唯有如此才能讓我們的實驗室各個環節都處在有效的質量控制下。