核酸酶保護實驗

實驗材料 核酸酶

試劑、試劑盒 ATPCTPGTPMUTPEDTANaCl甲酰胺Tris-HClRNase ARNase T1RNasinDTTUTPT7RNA聚合酶DNaseⅠ飽和酚氯仿酵母tRNANaAc無水乙醇SDS蛋白酶K異丙醇丙烯酰胺亞甲雙丙烯酰胺TBE尿素過硫酸胺TEMED

儀器、耗材 低溫離心機恒溫培養箱恒溫水浴鍋電泳儀保鮮膜

實驗步驟

1.  在一個高壓過的微量離心管中建立20 μl 的反應復合物如下：

（1）4 μl  5×轉錄緩沖液

（2）1 μl  200 mmol/的3NTP混合液

（3）10 μl  ［α-32P］CTP

（4）1 μl  胎盤核酸酶抑制劑

（5）1 μl  1 mg/ml 模板DNA

（6）1 μl  噬菌體RNA聚合酶

（7）SP6 RNA聚合酶反應時在40℃保溫30~60 min。采用T7或T3 RNA聚合酶則在37℃溫育。

2.  加人5 μg 或10 U 無RNA酶的酶 I，37℃溫育15 min。

3.  加入2 μl 10 mg/ml 的tRNA，補水至50 μl，以酚/氯仿/異戊酵抽提。

4.  水相加入200 μl，2.5 mol/l 乙酸銨和750 μl 無水乙醇，混勻后在冰浴飯置15 min，于4℃在微量離心機中離心15 min。

5.  重溶于50 μl 水，按第4步操作所述重新沉淀兩次，最后得到的沉淀以75%乙醇/25% 0.1 mol/l pH5.2的乙酸鈉緩沖液洗滌，晾干沉淀并溶解于100 μl 雜交液，取1 μl 計數。

6.  RNA以乙醇沉淀，并溶解于30 μl 含5×105 cpm RNA探針的雜交液中，于85℃加熱變性5 min，移至設定的雜交溫度（30~60℃），溫育8 h 以上。

7.  加入350 μl 含40 μg/ml 的核酸酶A和2 μg/ml 核酸酶T1的核酸酶消化緩沖液，于30℃溫育30~60 min。

8.  加入10 μl 20%SDS和2.5 μl 20 μg/ml 的蛋白酶K，37℃溫育30~60 min。

9.  用400 μl 酚/氯仿/異戊醇抽提，水相移入含1 μl 10 mg/ml tRNA的離心管中，加入1 ml 乙醇沉淀，晾干后溶解于3~5 μl RNA加樣緩沖液中。

10.  于85℃加熱變性3 min，在變性的聚丙烯酰胺/尿素凝膠（序列膠）中電泳，用增感屏放射自顯影過夜，分析結果。