根據分離機理的不同，高效液相色譜可分為液-固吸附色譜、液-液分配色譜（正、反相）、離子交換色譜、離子對色譜和分子排阻色譜。
1.液固色譜使用固體吸附劑，色譜柱上分離組分的原理是根據固定相對組分的不同吸附力進行分離 分離過程是吸附-解吸平衡過程。 常用的吸附劑是粒徑為5-10μ m的硅膠或氧化鋁 適用于分子量為200~1000的組分分離，其中大部分用于非離子化合物。離子化合物容易拖尾 它通常用于分離異構體。
2.液-液相色譜
使用固定相，該固定相通過在載體表面涂覆特定的液體物質或化學結合到載體表面而形成分離原理是根據分離出的組分在流動相和固定相中的不同溶解度進行分離分離過程是一個分配平衡過程。
涂層固定化具有相應的良好慣性；流動相必須預先用固定相飽和，以減少固定相從載體表面的損失。不同批次的溫度變化和流動相差異通常會導致色譜柱發生變化。此外，流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集變得復雜。因為涂覆的固定相對于避免靜止液體的損失是困難的，所以現在很少使用它目前主要采用化學鍵合固定相，如c18、c8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液相色譜法可根據固定相和流動相的極性分為正相色譜法（NPC）和反相高效液相色譜法。
正相色譜
極性固定相（如聚乙二醇、氨基和腈鍵合相）和流動相是相對非極性的疏水性溶劑（烷烴，如正己烷和環己烷）經常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃和氯仿來調節組分的保留時間常用于分離中等極性和強極性的化合物(如酚類，胺類，羰基和氨基酸等)
3.反相色譜
通常使用非極性固定相（如C18和C8)流動相是水或緩沖溶液。甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等水溶性有機溶劑常被加入以調節保留時間。 適用于分離非極性和極性較小的化合物 粉末冶金廣泛應用于現代液相色譜據統計占高效液相色譜總應用的80％左右。
隨著柱填料的迅速發展反相色譜的應用逐漸擴大并已應用于一些無機或易離解樣品的分析為了控制分析過程中樣品的解離，通常使用緩沖溶液來控制流動相的酸堿度。 然而，應該注意的是，C18和C8所用的酸堿值通常為2.5~7.5（2~8），過高的酸堿值會溶解硅膠，過低的酸堿值會導致鍵合的烷基基團脫落。 據報道，新的商業塔可在1.5 ~ 10的酸堿度范圍內操作。
正相色譜和反相色譜對比表
正相色譜反相色譜
固定相極性高~中~低
流動相極性低~中~高
組分洗脫順序極性小洗脫極性先大洗脫第一
從上表可以看出，當極性為介質時，正相色譜與反相色譜(如氨基鍵合固定相)之間沒有明顯的邊界。
4.離子交換色譜
固定相是一種離子交換樹脂，通常是由苯乙烯和二乙烯基交聯形成的聚合物骨架。羧基、磺酸基（稱為陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）附著在表面末端的芳環上。色譜柱上分離組分的分離原理是樹脂上的離子化離子與流動相中電荷相同的離子和被測組分的離子可逆交換，并根據每個離子的不同電荷吸引度進行分離。離子交換組。
緩沖液通常用作離子交換層析的流動相分離組分在離子交換柱中的保留時間不僅與組分離子和樹脂上離子交換基團之間的相互作用強度有關，還受流動相的酸堿度和離子強度的影響 酸堿度可以改變化合物的解離度，從而影響其與固定相的相互作用。 如果流動相中鹽的濃度很大，離子強度將很高，這不利于樣品的解離，導致樣品更快流出。
5.離子對色譜
也稱為偶離子色譜，是液-液色譜的一個分支該方法包括:根據被測組分離子和離子對試劑離子形成中性離子對化合物，增加在非極性固定相中的溶解度，從而提高中性離子對化合物的分離效果 主要用于分析離子強度高的酸堿物質。
用于分析堿性物質的常用離子對試劑是烷基磺酸鹽如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等此外高氯酸和三氟乙酸可以與各種堿性樣品形成強離子對。
四丁基季胺鹽，例如四丁基胺和四丁基胺磷酸鹽，通常用于酸性物質的分析。
ODS柱（即C18）通常用于離子對色譜。流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3 ~ 10[/小時/]毫摩爾/升離子對試劑，在一定的酸堿度范圍內分離被測組分的保留時間與離子對性質濃度流動相組成酸堿度和離子強度有關。
6.排阻色譜
固定相是具有一定孔徑的多孔填料，流動相是能夠溶解樣品的溶劑 小分子量化合物可以長時間進入孔隙。大分子量化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。 它利用分子篩對不同分子量組分排斥能力的差異來完成分離通常用于分離大分子化合物如組織提取物、多肽、蛋白質、核酸等。