檢驗醫學與感染病學（一）——感染性疾病常規檢驗概述

感染是病原體以某種傳播方式從傳染源傳播到易感者，并在宿主體內生長繁殖、釋放毒素或導至機體內微生態平衡失調的病理生理過程，大多數病原體是由外界侵入的，受病原體侵襲力、致病力及宿主免疫狀態等多種因素的影響，其破壞人體內的微生態平衡后機體產生各種不同的感染狀態，出現感染性疾病。

為了確定感染的發生及其性質，在疾病早期提供恰當的治療方案，并采取有效的預防措施，防止感染可能廣泛傳播所造成的危害，臨床上常需進行病原生物學檢驗。隨著廣譜抗菌藥物的廣泛應用甚至濫用，細菌耐藥性不斷增強。由耐藥菌尤其是多重耐藥菌引起的感染日趨嚴重。病原生物學檢驗也越來越受到重視，感染性疾病的早期診斷對疾病的診斷和治療至關重要。

細菌、螺旋體、支原體、放線菌、衣原體、立克次體、病毒，真菌、原蟲、蠕蟲等各種不同病原體所致感染性疾病不同，實驗診斷方法亦有區別。首先臨床微生物實驗室可以通過常規檢驗在顯微鏡下直接觀察病原體，或采用血清學反應檢出病原體抗原成分，或借助分子生物學方法檢測病原體核酸，并結合患者的病史、癥狀或體征作出初步診斷。然后對病原體進一步分離與鑒定以作出明確診斷。正確、規范采集和運送標本非常關鍵。此外，臨床實驗室在指導臨床選擇抗菌藥物，制訂治療和監控方案，避免耐藥菌株產生等方面也起著重要作用。

由實驗技術直接或間接獲得病原體及病原體結構成分，是確診感染性疾病的一個重要依據。臨床實驗室診斷細菌感染性疾病以分離培養技術為主，診斷病毒性疾病以免疫學方法為主。各種病原體感染后，刺激機休免疫系統產生相應的抗體或釋放某線抗原成分，可利用免疫學技術手段進行檢測，幫助某些感染性疾病的診斷或早期診斷。

臨床常見病原體實驗診斷方法有以下幾種。

一、直接顯微鏡檢查

1.不染色標本檢查

即采用懸滴法或壓滴法，在不染色狀態下借助暗視野顯微鏡或相差顯微鏡觀察病原體的生長、運動方式、螺旋體形態或運動。直接鏡檢結果對病原學診斷具有一定意義，如腦脊液涂片中查見革蘭染色陰性腎形雙球菌，結合患者發熱、噴射狀嘔吐、劇烈頭痛和腦膜刺激體征，可作出流行性腦脊髓膜炎的診斷。至于某件有正常菌群寄居的腔道分泌物，直接涂片鏡檢雖不能明確診斷，但對進一步檢查的方法和病原體分離鑒定所需培養基的選擇有重要提示作用。如米泔水樣便的懸滴法動力檢查，發現有運動活潑的魚群樣弧菌，常提示弧菌科細菌感染，可進一步用堿性蛋白胨水增菌，分離接種于硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽汁-蔗糖（TCBS）選擇培養基。濕式涂片有助于寄生蟲蟲卵檢查。

電子顯微鏡在臨床常規檢查中很少應用，但對某些病毒感染有確診價值，如嬰幼兒腹瀉，在其糞便中查見車輪狀的雙層衣殼病毒顆粒即可診斷為輪狀病毒感染。

2.染色標本檢查

標本直接涂片、干燥、固定后染色，或經離心濃縮集菌，涂片染色，置光學顯微鏡下觀察病原體的形態、染色性或觀察宿主細胞內包涵體的特征。

二、病原體的分離培養和鑒定

1.感染性細菌的分離培養

根據臨床癥狀、體征和顯微鏡下檢查特征作出病原學初步診斷。根據可疑菌生長培養特性，選擇合適的培養基，提供合適的氣體條件、溫度和pH環境，根據菌落性狀（大小、色澤、氣味、邊緣、光滑度、色素、溶血情況等）和細菌的形態、染色性，檢測細菌生化反應結果和血清學試驗，對分離菌作出鑒定；也可借助于微量鑒定系統，快速簡便鑒定分離菌。在鑒定細菌的同時，需做抗生素藥物敏感試驗。

2.不能人工培養的感染性病原體

根據不同的檢測目的，將標本接種于易感動物、雞胚或行細胞培養。接種動物后，可根據動物感染范圍、動物發病情況及潛伏期，初步推測為某種病原休。接種于雞胚的病毒，根據不同接種途徑的敏感性及所形成的特殊病灶。有助于初步鑒定。細胞培養的病毒，可依據細胞病變的特點或紅細胞吸附、干擾現象、血凝特性等縮小病毒的鑒定范圍，最后用血清學方法作最后鑒定。

三、病原體特異性抗原檢測

用已知抗體，借助免疫熒光技術、酶免疫技術、化學發光技術、膠乳凝集試驗等技術檢測標本中未知的病原體抗原，其診斷價值常依標本不同各異。標本中若存在多種正常寄居微生物，可因交叉抗原存在而不能確定診斷。只能在活細胞內增殖的病毒或立克次體、衣原體使用特異性好、效價高的單克隆抗體檢測，在設有嚴格的對照和排除試驗時，陽性的結果可作出準確的病原學診斷。

四、病原體核酸檢測

直接分析病原體的特異核酸來診斷感染的可能性，靈敏、快速和準確，具有很好的發展前景。核酸檢測適用于目前尚不能分離培養或很難分離培養的微生物。隨著探針標記技術的不斷改進，檢測試劑盒的商品化，操作更簡便易行，在臨床病原體實驗診斷中廣泛應用。核酸檢測技術主要有聚合酶鏈反應（PCR）、DNA探針雜交技術、基因芯片技術和序列分析等。

1.PCR

將待檢標本經細胞裂解液裂解后，在加有引物、四種三磷酸核苷、TaqDNA聚合酶和含Mg2+緩沖體系中，經變性、退火、延伸。在不同反應溫度進行多次循環，再將擴增DNA產物通過瓊脂糖凝膠電泳染色法、Southern印跡法、酶譜分析法和序列分析法四種方法之一，檢測出病原體的核酸。

2.探針雜交

將放射性核素或非放射性物質標記的已知序列核酸單鏈探針和固定在固相載體上的標本中病原體核酸退火形成雙鏈雜交休。通過雜交標記物的檢測，鑒定標本中的相應病原體基因。

3.生物芯片技術

通過縮微技術，根據分于間特異性地相互作用的原理，將生命科學領域中不連續的分析過程，集成于硅芯片或玻璃芯片表面的微型生物化學分析系統，以實現對細胞、蛋白質、基因及其他生物組分的準確、快速、大信息量的檢測。按照芯片上固化的生物材料的不同，可以將生物芯片劃分為基因芯片、蛋白質芯片、細胞芯片和組織芯片。生物芯片技術與傳統的儀器檢側方法相比具有高通量、微型化、自動化、成本低、防污染等特點。按照生物芯片的制作技術，可以將生物芯片劃分為微矩陣和原位合成芯片。

目前，最成功的生物芯片形式是以基因序列為分析對象的微陣列，也被稱為基因芯片或DNA芯片。按照載體上點的DNA種類的不同，基因芯片可分為寡核苷酸和cDNA兩種芯片。按照基因芯片的用途可分為表達譜芯片、診斷芯片、指紋圖譜芯片、測序芯片、毒理芯片等。

4.序列分析

指通過一定的方法確定DNA上核苷酸排列的順序，包括序列比對，序列分析即在核酸序列中尋找基因，找出基因的位置和功能位點的位置，以及標記已知的序列模式等過程。隨著全自動測序技術的快速發展，DNA測序結果通過生物信息學分析，獲取需要的信息，應用越來越廣泛。

5.其他體外擴增技術

分子生物學檢驗（分子診斷）技術發展迅猛，日新月異，如環介導等溫擴增（LAMP）、依賴核酸序列的擴增技術（NASBA）等技術，逐步在臨床實驗室得到應用。

五、血清學檢測