植物體內硝酸還原酶活力的測定(離體法)

【原理】

硝酸還原酶（NR）是植物氮素同化的關鍵酶，它催化植物體內的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽：

產生的亞硝酸鹽與對–氨基苯磺酸（或對–氨基苯磺酰胺）及α–萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性條件下定量生成紅色偶氮化合物。其反應如下：

生成的紅色偶氮化合物在540nm波長下有最大吸收峰，可用分光光度法測定。硝酸還原酶活性可由產生的亞硝態氮的量表示。一般以Nμg·g ﹣1 ·h ﹣1 為單位。NR的測定可分為活體法和離體法。活體法步驟簡單，適合快速、多組測定。離體法復雜，但重復性較好。

【儀器與用具】

離心機；分光光度計；冰箱；研缽；試管等用具同活體法。

【試劑】

0.1mol/L pH7.5的磷酸緩沖液；0.1mol/L KNO 3 磷酸緩沖液；1%（W/V）對–氨基苯磺酸溶液；0.2%（W/V）α-萘胺溶液（上述溶液配法同活體法）。

NADH 2 溶液：稱取2.0mg NADH 2 溶于1ml 0.1mol/L的磷酸緩沖液中（冰箱貯存可用一星期）；

提取緩沖液（25mmol/L的磷酸緩沖液、5mmol/L半胱氨酸、5mmol/L EDTA-Na 2 混合液）：取250ml 0.1mol/L磷酸緩沖液，加半胱氨酸0.61g；EDTA-Na 2 1.86g，溶解后用KOH溶液調pH至7.5，定容1000ml。

【方法】

1. 取材料2g，洗凈剪碎，放在研缽中置低溫冰箱冷凍30min。取出在冰浴中加少量石英砂和提取緩沖液（玉米、小麥、水稻分別按每克鮮重1ml，2ml和4ml分兩次加入）。研磨為勻漿，低溫離心5min（4000r/min）。上清液即為粗酶提取液。上述操作盡量在冰浴中進行。

2. 取0.4ml粗酶提取液，1.2ml 0.1mol/L KNO 3 磷酸緩沖液，0.4ml NADH2溶液加入備好的刻度試管中混勻，在30℃下保溫30min，對照不加NADH 2 ，以0.4ml蒸餾水代替。

3. 保溫后立即加1ml對-氨基苯磺酸溶液終止反應，加1mlα-萘胺溶液，顯色20min，在臺式離心機上離心10min，上清液在分光光度計上測波長540nm處光密度。

4. 標準曲線制作和結果計算同活體法。

【注意事項】

1. 硝酸鹽還原過程應在黑暗中進行，以防止亞硝酸鹽還原為氨。加異丙醇可增加組織對NO 3－和NO 2－的透性，厭氧條件可防止氧競爭還原吡啶核苷酸。

2. 取樣前材料應照光3h以上，大田取樣在上午9點后為宜，陰雨天不宜取樣。取樣部位應盡量一致。

3. 配好的KNO 3 磷酸緩沖液應密閉低溫保存，否則易滋生微生物將NO 3－還原，使對照吸光值偏高。

4. 從顯色到比色時間要一致，過短過長對顏色有影響