植物基因組DNA提取、酶切及電泳分析

一、目的
 掌握植物基因組DNA提取的一般方法及注意事項。大分子量DNA分子的酶切分析。

 二、原理
 十六烷基三乙基溴化胺是一種去污劑，可溶解細胞膜，它能與核酸形成復合物，在高鹽溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，當降低溶液鹽濃度到一定程度(0.3
 mol/L
 NaCl)時，從溶液中沉淀，通過離心就可將CTAB與核酸的復合物同蛋白質、多糖類物質分開，然后將CTAB與核酸的復合物沉淀溶解于高鹽溶液，再加乙醇使核酸沉淀，CTAB能溶解于乙醇。

 三、試劑與器材
 （一）、試劑
 1 、DNA extraction ：500ml
   31.885g  sorbitol (山梨醇)
   6.05g    tris   PH8.2  (一般不調)
 2、Nuclei lysis buffer: 500ml
   100ml       1M  Tris PH7.5
   100ml       0.25M  EDTA
   200ml       5M    NaCl
   10g         CTAB
   100ml       ddH2O
 3、5% sarkosyl (N-月桂酰肌氨基鈉鹽)  500ml
    用時，將上述三種溶液按1：1：0.4 比例混勻，加入亞硫酸氫鈉（3.8g/l），65℃預熱，既為抽提液。
 （二）器材
     恒溫水浴、研缽、電泳設備

 四、操作步驟
 （一）、基因組DNA提取
 1
 取0.15g左右小麥葉片，在液氮中研磨后放入1.5ml離心管中，加入700ml抽體液（65℃預熱）混勻，放入65℃水浴中，裂解40-60分鐘，期間溫和混勻幾次。
 2 取出裂解好的DNA ，加入700ml氯仿：異戊醇（24：1），猛烈混勻，離心（1000rpm，10分鐘）。
 3 取上清于新管中，（不要混入氯仿），加入0.8-1倍預冷異丙醇，緩慢混勻后，再猛烈混勻，使DNA成團，-20℃放半小時以上。
 4 將析出的DNA 離心，14000rpm，10分鐘。
 5 去掉上清，將沉淀用1ml 70% 乙醇清洗一次，離心 干燥，溶于50ml ddH2O。

 （二）、酶切及電泳分析
   取四支1.5ml離心管，分別寫上標記：g/EcoRⅠ（學號）、g/HindⅢ（學號）、λ/EcoRⅠ（學號）和λ/ Hind Ⅲ（學號）。
   前兩支試管加入30 ml基因組DNA。后兩支試管加入3mlλ基因組DNA。
   前兩支加入5 ml 10×buffer。后兩支加入2ml 10×buffer。
   前兩支分別加入ddH2O 12.5ml，后兩支分別加入ddH2O 13ml
   分別加入RNase 1 ml。
   前兩支試管分別加入1.5 ml  EcoRⅠ和Hind Ⅲ，10000rpm離心20 S混勻。前兩支試管分別加入1 ml EcoRⅠ和Hind
   Ⅲ，10000rpm離心20 S混勻。
   37℃反應4h
   0.8%瓊脂糖凝膠電泳（樣品全部點樣）。
   觀察記錄并分析實驗結果