植物總RNA的提取實驗技術

一、實驗目的
通過本實驗學習從植物組織中提取RNA的方法
二、實驗原理
RNA是一類極易降解的分子，要得到完整的  RNA，必須最大限度地抑制提取過程中內源性及外源性核糖核酸酶對RNA的降解。高濃度強變性劑異硫氰酸胍，可溶解蛋白質，破壞細胞結構，使核蛋白與核酸分離，失活RNA酶，所以RNA從細胞中釋放出來時不被降解。細胞裂解后，除了RNA，還有DNA、蛋白質和細胞碎片，通過酚、氯仿等有機溶劑處理得到純化、均一的總RNA。
三、儀器、藥品與試劑配方
(一) 儀器
1． 低溫離心機
2． 分光光度計
3． 瓊脂糖膠電泳系統，用前先用1% Na OH溶液浸泡過夜，之后再用DEPC水浸泡沖洗。
4． 高壓滅菌鍋
5． 研缽、剪刀、一次性手套等
易 (二) 藥品
1. 焦碳酸二乙酯(DEPC)
2. 嗎啉代丙烷磺酸(MOPS)
3. 異硫氰酸胍
4. 醋酸鈉(NaAc)
5. 氯仿
6. 苯酚
7. 甲醛
8. 乙醇
9. 乙二胺四乙酸(EDTA)
10. 瓊脂糖
11. 異丙醇
(三) 試劑配方
1． 0.1% DEPC水
0.1 ml DEPC 加入 100 ml三蒸水中，振搖過夜，再濕熱滅菌。
2. 2 mol/L NaAc、0.5 mol/L EDTA、4 mol/L異硫氰酸胍、 4 mol/L LiCl等均用DEPC水 配制。
3. 5ΧMOPS 電泳緩沖液 (pH 7.0)
MOPS 0.1 mol/L
NaAc 40 mmol/L
EDTA 5 mmol/L
四、實驗步驟
（一） 總RNA的提取（方案一）
1. 實驗前10天左右播種水稻種子，在3-4葉期，剪取1.2 g幼葉。放入研缽，在液氮中研磨成粉末狀，移入10 mL離心管。加入
4 mol/L異硫氰酸胍 4 mL
苯酚 3 mL
2 mol/L NaAc (pH 4.8) 0.3 mL
氯仿 0.6 mL
混勻，冰浴放置30 min。
2. 4℃，8000 r/min，離心13 min。
3. 棄沉淀，取上清至另一干凈無菌離心管中。
4. 加入2倍體積無水乙醇，-70℃，0.5 h。
5. 4℃，8000 r/min，離心13 min。
6. 棄上清，在沉淀中加入1 mL 4 mol/L LiCl，使其溶解。
7. 移入1.5 mL離心管中，冰浴2 h。
8. 4℃，13000 r/min，離心15 min。
9. 棄上清，在沉淀中加入400 uL DEPC水，再加入400 uL氯仿，混勻。
10. 4℃，13000 r/min，離心6 min。
11. 取上清，并加入1/10體積3 mol/L NaAc（pH 5.0），2倍體積無水乙醇，-20℃，放置 30 min。
12. 4℃，13000 r/min，離心20 min。
13. 將沉淀RNA用70%乙醇洗滌2次。
14. 將沉淀RNA室溫下稍干燥。
15. 加30 uL DEPC水溶解，-70℃保存。
（二） 總RNA的提取（方案二）
利用TRIzol提取液抽提RNA，具體步驟如下：
1. 取幼葉約250 mg在液氮中研磨至細粉，轉入預冷的1.5 ml離心管；
2. 加入1 ml TRIZOL提取液震蕩搖勻；
3. 室溫放置5 min后，加入0.5 ml的氯仿，劇烈搖動離心管5 min；
4. 在 8℃條件下，12000 rpm離心15 min；
5. 溶液分為兩層，下層為酚－氯仿淺紅色液層，將上層液體移入干凈離心管， 加入 0.5 ml異丙醇在15~30℃條件下，沉淀10 min；
6. 然后在, 2~8℃條件下，12000 rpm離心10 min，RNA沉淀管壁和底部；
7. 去掉液體部分，加入1 ml 75%酒精洗2次；
8. 風干后，加入25 μl DEPC處理過的水溶解 RNA，儲藏于-80℃冰箱備用。

（三）甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳分析總RNA
1．配制1.2%變性瓊脂糖凝膠 (40 mL)
稱取0.48 g,加入DEPC水25.2 mL,5X電泳緩沖液4 mL, 加熱使溶解，稍冷卻加入甲醛 3.4 mL, 混勻，室溫凝固0.5-1 h.
2. RNA電泳檢測樣品制備

混合液輕輕混勻并離心，放于65℃下溫育 5 min后，置于冰上。
3. 電泳檢測
將1.2%變性瓊脂糖凝膠放入水平電泳槽中，加 1×MOPS電泳緩沖液，覆蓋凝膠約1 mm。將RNA樣品加到凝膠點樣孔中，在5 V/cm條件下電泳30 min，然后在EB中染色 15-20 min，在紫外燈下觀察提取的RNA的質量。
五、注意事項
1．在研磨過程中，利用液氮時刻使組織保持冰凍狀態。
2．RNA 酶是一類生物活性非常穩定的酶類，除了細胞內源RNA酶外，外界環境中均存在RNA酶，所以操作時應戴手套，并注意時刻換新手套。