實驗方法原理 在液氮中研磨植物材料, 使部分細胞破碎, 進一步使植物細胞在裂解液中裂解, 用醋酸鈉和氯仿沉淀蛋白質, 異丙醇沉淀核酸, 溶解后經氯化鋰沉淀總RNA, 洗滌后得到高質量的RNA。本實驗旨在了解和掌握植物總RNA 的分離和純化方法。
實驗材料 植物RNA
試劑、試劑盒 尿素Tris-HClNa2 EDTANaClTris飽和酚SDSLDS醋酸鈉氯仿-異戊醇異丙醇TE 緩沖液LiCl乙醇
儀器、耗材 研缽燒杯離心機
實驗步驟
取5～10 g 材料放入研缽中, 加入過量液氮, 迅速研磨成均勻的粉末(在研磨過程中, 保證材料始終浸在液氮中, 研磨約30 min) 。
待液氮自然揮發干凈后, 將材料轉入100 ml 的離心管中, 加入6 ～ 8 倍體積的裂解液1 , 輕輕攪拌后, 0 ℃ 冰浴20 min。12000 r/ min , 4 ℃離心15 min。
取上清, 加入1/ 3 體積的3 mol/ L 醋酸鈉, 1/ 5 的氯仿異戊醇, 輕輕搖勻, 0 ℃冰浴20 min。
2000 r/ min , 4 ℃離心15 min ( 加5 倍體積裂解液2 溶解沉淀以提取DNA)。
取上清, 加入等體積冰浴冷卻的異丙醇, 混勻且冰浴10 min。
5000 r/ min , 4 ℃ 離心10 min , 將沉淀溶于5 ml 含有0 . 1%SDS 的TE 緩沖液中, 加入8 mol/ L LiCl 使終濃度至2 . 5 mol/ L,冰浴3 h 或4 ℃過夜。
12000 r/ min , 4 ℃離心10 min。
70%乙醇洗滌沉淀兩次, 空氣干燥10 min , 溶于無菌水(DEPC 焦碳酸二乙酯, 處理) , 加入1/ 10 體積10% 的SDS, 重復第4～6 步驟, 進一步除去蛋白質, 70%乙醇20 ℃長期保存。