植物病毒分離方案

方案一：

帶病毒的植物葉、莖、果實、根等粉碎后—20℃冰凍后制成勻漿→用0.5M，PH7.0檸檬酸緩沖液抽提→雙層紗布過濾→濾液加入6%PEG（MW6,000）及3%Nacl，充分攪拌40分鐘，置冰箱4℃過夜→高速冷凍離心機8×50ml轉頭，7000rpm，4℃離心20分鐘，棄上清，取沉淀→沉淀是浮于0.005M，PH8.5的硼酸緩沖液（含0.05M尿素或1%，Triton X-100）中，7000rpm，4℃離心20分，取上清液→超速離心：10%～40%蔗糖梯度，日立P40ST轉頭30,000rpm，4℃離心3小時→每管自上而下收集成30管，每管約400μl，分別做260nm及280nm O.D.，繪成曲線，收集病毒帶（峰前后收集管）。根據260nm及280nm的O.D.值的比值估計樣品的純度

方案二：

帶病毒的植物葉、莖、果實、根等粉碎后—20℃冰凍后制成勻漿→加5倍體積的0.1M，PH8.2的硼酸緩沖液（含2%PVP，2%尼古丁，0.01M EDTA和0.2%硫基乙醇）攪拌，雙層紗布過濾→濾液在高速冷凍離心機6,000rpm，4℃離心20分→取上清液，加入6%PEG（MW6000），0.1M Nacl和1% Triton X-100，冰浴中攪拌至完全溶解，4℃過夜→高速機10,000rpm，4℃離心30分鐘→取沉淀，懸浮于0.01M PH7.2的磷酸緩沖液（含0.001M EDTA和0.1% PVP）10,000rpm，4℃離心30分鐘→取上清液，P40ST轉頭每管內鋪5ml用以上懸浮液配置的20% w/w蔗糖（分析純），上部鋪上清液至距管口3mm，35,000rpm，4℃離心3小時→取沉淀，用以上懸浮物稀釋后10,000rpm，4℃離心20分→取上清液，P40ST轉頭，10%～40%蔗糖梯度，每管樣品約1ml，28,000rpm，4℃，3.5小時→從上部開始收集成30管，每管約400μl，分別測O.D.，繪成管數（橫坐標）對O.D.（豎坐標）曲線，找到病毒峰所在離心管（取3-5管）→稀釋后40,000rpm，4℃離心2小時→沉淀，懸浮即為純病毒成份。