植物組織培養中常用滅菌方法（一）

常用的滅菌方法可分為物理的和化學的兩類，即：物理方法如干熱（烘燒和灼燒）、濕熱（常壓或高壓蒸煮）、射線處理（紫外線、超聲波、微波）、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇水、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學藥品處理。這些方法和藥劑要根據工作中的不同材料不同目的適當選用。

1、培養基用濕熱滅菌
培養基在制備后的24小時內完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內溫度也隨之增加。在0.1mpa的壓力下，鍋內溫度達121℃。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。

注意完全排除鍋內空氣，使鍋內全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關閉放氣閥，通電后，待壓力上升到0.05mpa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關閉放氣閥。

關閥再通電后，壓力表上升達到0.1mpa時，開始計時，維持壓力0.1-0.15mpa，20分鐘。
按容器大小不同，保壓時間有所不同。見表1。該表所列數字是徹底滅菌很保險的數字，如果容器體積較大，但是放置的數量很少，也可以減少時間。

表1. 培養基高壓蒸汽滅菌所必需的最少時間

到達保壓時間后，即可切斷電源，在壓力到0.5mpa，可緩慢放出蒸汽，應注意不要使壓力降低太快，以致引起激烈的減壓沸騰，使容器中的液體四溢。當壓力降到零后，才能開蓋，取出培養基，擺在平臺上，以待冷凝。不可久不放氣，引起培養基成分變化，以至培養基無法擺斜面。一旦放置過久，由于鍋爐內有負壓，蓋子打不開，只要將放氣閥打開，大氣壓入，內外壓力平衡，蓋子便易打開了。

對高壓滅菌后不變質的物品，如無菌水、栽培介質、接種工具，可以延長滅菌時間或提高壓力。而培養基要嚴格遵守保壓時間，既要保壓徹底，又要防止培養基中的成分變質或效力降低，不能隨意延長時間。

對于一些布制品，如實驗衣、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅局20-30分鐘。
高壓滅菌前后的培養基，其ph值下降0.2-0.3單位。高壓后培養基ph值的變化方向和幅度取決于多種因素。培養基中成分單一時和培養基中含有高或較高濃度物質時，高壓滅菌后的ph值變化幅度較大，甚至可大于2個ph值單位。環境ph值的變化大于0.5單位就有可能產生明顯的生理影響。

高壓滅菌通常會使培養基中的蔗糖水解為單糖，從而改變培養基的滲透壓。在8%-20%蔗糖范圍內，高壓滅菌后的培養基約升高0.43倍。

培養基中的鐵在高壓滅菌時會催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培養基值小于5.5，其水解量更多，培養基中添加0.1%活性炭時，高壓下蔗糖水解大大增強，添加1%活性炭，蔗糖水解率可達5%。

為防止高壓滅菌產生的上述一些變化可用下列方法：
（1）經常注意搜集有關高壓滅菌影響培養基成分的資料，以便及時采取有效措施。
（2）設計培養基配方時盡量采用效果類似的穩定試劑并準確掌握劑量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以IBA代替IAA，控制活性炭的用量（在0.1%以下）注意ph值對高壓滅菌下培養基中成分的影響等。
（3）配制培養基時應注意成分的適當分組與加入的順序。如將磷、鈣和鐵放在最后加入。
（4）注意高壓滅菌后培養基ph值的變化及恢復動態。如高壓滅菌后的ph值常由5.8升高至6.48。而96小時后又會降至5.8左右。這樣在實驗中就可以根據這一規律加以掌握。

2、用于無菌操作的器械采用灼燒滅菌

在無菌操作時，把鑷子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精燈火焰上灼燒滅菌。冷卻后，立即使用。操作中可采用250或500毫升的廣口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。

3、玻璃器皿及耐熱用具采用干熱滅菌
干熱滅菌是利用烘箱加熱到160-180℃的溫度來殺死微生物。由于在干熱條件下，細菌的營養細胞的抗熱性大為提高，接近芽孢的抗熱水平，通常采用170℃持續90分鐘來滅菌。干熱滅菌的物品要預先洗凈并干燥，工具等要妥為包扎，以免滅菌后取用時重新污染。包扎可用耐高溫的塑料。滅菌時應漸進升溫，達到預定溫度后記錄時間。烘箱內放置的物品的數量不宜過多，以免防礙熱對流和穿透，到指定時間斷電后，待充分冷涼，才能打開烘箱，以免因驟冷而使器皿破裂。干熱滅菌能源消耗太大，浪費時間。