植物組織培養中的無菌技術

一、目的要求 

通過實驗掌握植物組織培養中的無菌操作技術。學習培養基的配制及滅菌，掌握植物外植體表面消毒的常規方法。

二、基本原理

近年來，植物組織培養作為一種研究技術已被廣泛。植物組織培養是應用無菌操作方法培養植物器官或組織地任何一部分，甚至單個細胞的觀察。植物組織培養中的無菌技術主要包括培養基的配制與滅菌。

1．MS 培養基的配制：

對植物外植體進行離體培養時，培養基提供生長所需的營養成分等。不同材料對培養基的要求不同，適當地設計和選用培養基，對植物組織培養取得成功是至關重要的。另外，對組織培養物的脫分化和再分化等狀態的調控、次生代謝產物的生產等都是通過調節培養基成分來實現。培養基的主要成分包括無機營養物、碳源、維生素、植物生長物質和有機附加物等。植物生長物質是培養基中的關鍵物質，對外植體愈傷組織的誘導和分化起著重要的調節作用。配制培養基通常都按配方濃度的若干倍稱量，配制成一系列的母液置于冰箱保存，使用時按比例稀釋。一般要配下列母液：大量元素母液、微量元素母液、鐵鹽母液、植物生長物質母液、有機化合物母液。

2．培養基滅菌：

凡是暴露在（未經處理的）空氣中的物體，曾經接觸過自然水源的物體都是有菌的。培養所用的培養基含有植物細胞生長所必需的各類營養物質，也是各種細菌、真菌滋生繁殖的極好場所。組織培養必須采用無菌技術，在取材、接種、培養的整個過程中，必須嚴格進行培養基和培養材料的滅菌，同時，嚴格進行無菌操作，防止污染。

3．植物外植體消毒和接種：

用于進行組織培養的組織、器官和細胞稱為外植體。在組織培養中，外植體如果是帶菌的，在接種前都必須進行表面消毒，這是取得培養成功的最基本的和重要的前提。常用消毒劑對外植體進行消毒。從室外取的材料，一般先用自來水沖洗數分鐘，對表面不光滑或長有絨毛等結構不容易洗凈的材料，自來水沖洗的時間要長，幾個小時或過夜，并且用洗衣粉或洗潔精洗滌，必要時用毛刷刷洗。洗后的材料用濾紙擦干，然后浸泡在消毒溶液中。接種材料使用消毒劑后，要用無菌水洗滌3～5 遍，最后用無菌紙擦干凈。使用消毒劑的原則是既要達到消毒目的，又不能損傷植物組織和細胞，還要符合就地取材的原則。對一些容易污染、較難滅菌的外植體進行表面消毒時，用單一消毒劑不能收到好的效果，所以常選用兩種消毒劑交替浸泡法。一般，首先用75％乙醇浸泡外植體數秒鐘至30s，然后置于0.1％氯化汞溶液5～10min 或含有2％活性氧的次氯酸鈉溶液5～30min，然后用無菌水洗滌。有時在氯化汞或次氯酸鈉滅菌后，用無菌水洗，進一步剝去幾層組織或器官如葉片后，再用次氯酸鈉滅菌3～5min，無菌水漂洗3 次后，切割、用于接種。

用消毒劑對接種材料進行滅菌處理時，可以在滅菌溶液中加入1～2 滴表面活性劑，如吐溫80或吐溫20，它們可以濕潤外植體整個組織，促進滅菌液充分接觸表面組織，達到較好的消毒效果。有時還可以用磁力攪拌、超聲振動等方法使消毒殺菌劑進入外植體。消毒溶液對外植體消毒是在超凈工作臺上進行。完成表面消毒的接種材料要盡快放置于培養基中。

三、器材 

1． 試劑 ：硝酸胺，硝酸鉀，磷酸二氫鈉，硫酸鎂，氯化鈣，硫酸鐵，乙二胺四乙酸，2，4 -D ,BA lmol/L 鹽酸，lmol/L 氫氧化鈉、0.1％氯化汞（劇毒!）, 75％乙醇無菌水，無菌培養皿，MS 培養基。

2 ．器具：電子天平，冰箱，pH 試紙，燒杯，量筒， 試劑 瓶，三角瓶，吸耳球，刻度吸管，洗瓶、高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、各種接種工具、無菌紙、一次性手套、酒精燈、標簽紙、記號筆、鑷子、剪刀、解剖刀。

3 . 材料:胡蘿卜塊根、綠豆種子、非洲澎蜞菊葉片。

四、操作步驟

（一）培養基配制的一般操作程序是（圖1－1,表1－1）：

1 ．大量元素母液的配制：

圖1－1 培養基配制操作程序

2 ．鐵鹽母液配制：按MS 培養基配方所列FeSO4·7H2O 和EDTA－Na2·2H2O 含量擴大100 倍進行實際稱量，依大量元素母液的步驟，配制母液300mL ，貼上標簽，10℃保存。

3 ．植物生長物質母液配制：本實驗分別配制500mg/L 2,4-D 和300mg/L 6-BA 母液。

4 . 培養基配制： 見表1－2。

表1－1 配制MS 培養基母液種類

表1－2 從MS 培養基母液配制培養基

（二）植物外植體消毒和接種：

1 ．接種前，用75 ％乙醇棉球或用2％苯扎溴銨溶液擦拭超凈工作臺臺面，將培養基及用具放入工作臺，開超凈工作臺紫外燈照射至少20 min，然后開送風開關，之后關閉紫外燈，通風10 min后，再開日光燈進行無菌操作。

2 ．將胡蘿卜塊根在自來水下沖洗干凈，用小刀切去外圍組織，切成小塊分別放100 mL 燒杯中，用75％乙醇溶液浸泡30s，然后用0.1%氯化汞溶液分別浸泡2 、5 、10 min ，用無菌水洗滌3 次，無菌紙吸干水分。取出培養皿，剪刀和鑷子使用前插入90％乙醇溶液中，使用鑷子時在酒精燈火焰上熾燒片刻，冷卻后，切取髓部組織0.5cm 。以上操作都要在 試管 口靠近火焰旁。

3 ．將培養容器斜面向上，并使它們拉于水平位置，也可將培養容器放在左手中。將塞蓋用右手擰轉松動，以便接種時拔出。用火焰灼燒管口，灼燒時應不斷轉動 試管 口（靠手腕的動作，使試管口沾染的少量菌得以燒死）。將燒過的接種針（環）觸動培養基部分，使其冷卻，以免燒死被接種的外植體，然后輕輕接觸外植體，慢慢將接種針（環）抽出試管，打開培養容器蓋，將外植體放在培養基上，每瓶放3 塊。封口，貼標簽，注明姓名，標明時間和材料名稱。整理好接種室（箱）的臺面，搞好清潔衛生。

4 ．用水洗干凈非洲澎蜞菊葉片，用濾紙擦干后置于100 mL 燒杯 中，在 超凈工作臺 上加入75％乙醇溶液浸泡30s，然后用0.1％氯化汞溶液浸泡3 、5 、7 min，用無菌水洗滌3 次，將葉片切成長1cm ,按照上述同樣的步驟接種于培養基上。

5 ．綠豆種子用75％乙醇溶液浸泡30 s，然后用0.1％氯化汞溶液（加入吐溫2 滴）浸泡3 、5 、10 min ，期間不斷攪拌溶液，用無菌水洗滌5～6 遍，洗干種子外圍水分，按照上述同樣的步驟接種于培養基上。

五、實驗報告

1. 用表格表示高壓消毒滅菌的效果，如培養基、工具的消毒數目和消毒2 天后污染情況。

2. 觀察接種材料（葉片、種子或胡蘿卜肉質根）接種后2～5 天的污染情況，用表格表示接種材料的數目、污染的外植體數，并計算污染率。污染率（% ) = （污染的材料數／總接種材料數×100%

如果培養材料大部分發生污染，說明消毒劑浸泡的時間短；若接種材料雖然沒有污染，但材料已發黃，組織變軟，表明消毒時間可能過長，組織被破壞死亡；接種材料若沒有出現污染，生長正常，即可以認為消毒劑使用濃度的適宜消毒時間。

六、思考題 

1 ．高壓蒸氣滅菌開始之前，為什么要將鍋內冷空氣排盡？滅菌完畢后，為什么待壓力降低“0” 時才開蓋取物？

2．為什么要配制母液？各種母液擴大的倍數如何確定？

3 ．有時在培養基中加入活性炭、果汁、蔬菜汁，它們分別起什么作用？

4 ．植物生長物質為什么要單獨配制母液？

5 ．外植體用消毒劑消毒后，為什么要用無菌水漂洗？為什么常在消毒溶液中加入1～2 滴表面活性劑（如吐溫）?

6．在接種過程中，通過哪些措施來防止細菌對接種工具、接種材料的污染？3 ．對外植體表面消毒時為什么常用“兩次消毒法”?