植物組織培養技術知識匯總（二）

三、生根

生根是獲得完整植株的一個關鍵。通過側芽和不定芽途徑產生的芽長成嫩枝后(此時的嫩枝叫試管苗)，必須誘導生根才能移植。促使試管苗生根的方法通常有兩種。一種是在固體培養基上誘導生根。當試管苗長到2～3厘米高時，將它從基部切下，轉移到只含0.2～0.5毫克/升的萘乙酸或吲哚丁酸的固體培養基上生根。

另一種是浸泡的方法，將切下的無根試管苗泡在含有高濃度生長素溶液中，生長素濃度為100毫克/升左右，浸泡時間從幾小時到1天，然后取出接種于不加任何激素的MS培養基上，十天左右即可生根。

以上兩種方法，在更換培養基后，經過幾天，都要將試管苗的瓶口打開，上蓋1～2層紗布，以便于通氣。并要適當加強光照，以增加試管苗的自養能力。

四、移栽

當試管苗的根原基突起或形成幾毫米長的短根時，將其取出，洗去瓊脂，載入有少量營養的人工基質中。移栽后，保持高濕度，避免陽光直射和過大的溫度波動，經過一段逐步鍛煉的過程，再定植到土壤中。

在移栽過程中，試管苗的環境條件發生了劇烈的變化，其本身又從異養變到自養，葉的光合作用和根的吸收作用需要逐漸發展。因此移栽時要小心控制，使試管苗逐步鍛煉，最終能在土壤中生活。

第六部分 植物組織培養苗之污染來源與污染鑒定

一、在組織培養中污染來源

1. 植物本身具有：

(1)植物病原菌 有些作物的病害已被透徹研究，因此在大量繁殖時，可立即檢查出來，但有些則否，造成若有污染時，不知來源為何。

(2)和植物有關的菌類 有修植物本身便會和一些菌種共生，或是寄生于植物內部。

2. 植物所帶入的污染：內在污染源

許多植物表面或大氣中生存的微生物，可經由植物自然的開口或傷口進如植物內部，而有一些兼性腐生菌或絕對寄生菌，可藉由載體或是擁有一些侵入的機制侵入植物內部，依其存在的地方分為

1. 細胞內-inter 2. 細胞間隙-interacellular 種類有：virus病毒、viroids類病毒、prokarytoes原核生物、fungi真菌、柔膜綱(ex:mite)、立克次體。

3. 操作室：外在污染源

在組織大量培養下，除了植物本身外，大部分最有可能的污染來源便是來自操作室。依其可能原因分析為：

(1)空氣

在操作室中，未過濾空氣帶有大量的微生物，隨者操作人員或植株接觸時，而污染培養皿。故在國外對于操作室內空氣的清潔度分為四種等級：

ClassⅠ.沒有容易培養的微生物，和作物之主要病原菌

Ⅱ.沒有容易培養的微生物，和作物特殊病原菌

Ⅲ.沒有容易培養的微生物

Ⅳ.未做檢測

(2)不完全的滅菌設備或技術

因為使用滅菌不完全的設備或是技術，而導致植株或培養皿的污染，例如：有些酵母菌，可避免酒精消毒，還有一些會產生內孢子，而避免火焰消毒。

(3)人員

在整個操作室內，人員可說是最大的帶菌者，其不管在毛發或是衣服等，都隱藏屬不清的菌。在進入操作室前，最好能將作業人員清潔處理，然后換上脫鞋，或是將塵土去掉。

(4)細縫的存在 因為若操作室有細縫的存在，則造成外果氣體直接流入，使得空氣中菌數增加。

(5)操作臺上的濾網不干凈 因為使用過久，或不當保養，而造成濾網壞掉，而產生更多的污染。

(6)蹣及薊馬的存在 此為珠形網，具有活動能力，能到處跑來跑去。因此常造成散亂的污染。

4.栽培過程污染 在栽培室，組培瓶外和外界氣體交換時，亦會有污染進入。污染機率取決于空氣中帶菌密度與組培瓶空氣交換率。

二、污染的種類及形式

1. 污染的形成 依據污染的來源，可將污染分為三個形式：

a.由植物內部或病原菌所造成的污染 植物內部或病原菌所造成的污染，所呈現是系統性，及從stageo~stage4中都可發現，而且占有一定的百分比。

b. 在制造時所造成的污染 如因蹣或是空氣中的關系造成的污染，其所表現的方式是散亂(random)性非系統性，且不集中于某一地方，占的百分比也不一定，是機率性。

c. 技術上的失誤 其呈現方式有一定性，例如由此工作臺所生產得植株都被污染，表現為帶狀性，可用卷標方式來追蹤，以進而改善。

2. 污染的來源分類

A、污染的種類，以總體來說可分為下列幾種：

a.病毒(virus)-常存在植物內部。 b.(viroids)常存在植物內部 c.細菌-在組織培養中又分依其來源和所在地方分類如下：

(a) phlem-eimited生長于韌皮部

xylem-eimited生長于木質部

(b)植物病原細菌

(c)空氣中存在的細菌，但因植物有傷口，或是營養豐富的地方，可分為植物表面的細菌或植物內部的細菌。

例如：Bacillus spp.可抗熱，在不完全滅菌的玻璃器皿中可發現。

(d)菌質體 是一種像細菌的微生物，但是本身沒有細胞壁，可以在培養基培養，亦可用特殊的抗生素(四環霉素)抑制其生長。其種類有microplasm與spiroplasm。

(e)真菌

在植物病害中，真菌所引起的病害特別多且嚴重，且因其會產生孢子，所以會隨著空氣飄散。一旦落于適當的環境下，一粒小小的孢子便會擴大成一個菌落，污染整個組織培養瓶。例如常見的酵母菌，其菌落為粉紅色，若有其出現，則其污染來源可能來自空氣。

(f)蹣或薊馬 此為細小的微生物，具有活動能力，喜歡吃菌絲。在國內使用期限較久的組培場中常出現此問題。

(g)立克次體 目前未清楚其污染方式。

B、以培養難易區分污染源

1. 在培養基中易培養菌類 細菌，真菌，蹣。

2. 在培養基中不易培養的菌類 病毒，類病毒，立克次體，菌質體。

在組織培養過程中，常造成污染或是造成威脅的菌類，稱為培養菌類。因常為腐生菌，且營養需求不高(隨便吃，隨便活)所以常造成成本的增加。而且污染后，常使培養基的pH值降低，洋菜無法凝結，而使植物無法生長或是產生有毒物質或副產品，使得植物生長緩慢，或是干脆就在植物上生長。在培養基上不易培養或是不能培養的菌種，就不會造成太大的威脅。

C、各種菌種其主要傳播方式

1. 病毒，類病毒，菌質體-常利用機械或利用有載體傳播。

2. 細菌-可經人力，氣流或水，及昆蟲等傳播。

3. 真菌-亦同上，但孢子可經空氣傳播。

4. 薊馬-同上，具活動力，自由運動，應慎防出現。

D、依其菌落生長出現的快慢區別

1. 可見的菌落在組織培養中。一些易培養的菌類，其生長特性為快速蔓延整個組培瓶。但此種污染可利用工作人員之視覺觀察將之偵測出來將之銷毀，對后代植株造成威脅不大。

2. 潛藏的菌落-在組織培養中有些不易培養或是在植物內部寄生或共生的菌類或病原菌，在培養時沒有表現出來，但是有存在或只有很微弱的表現，但是未被察覺出來。于是便造成了對后代植株的重大威脅及成本的增加。

其污染未明顯表現出的原因有下列幾項：

a在培養基中含有抗生素，則菌類不易生長。.

b.在培養基中，因植物本身的汁液含有某些特殊的成分例如：單寧酸，因此抑制菌類表現。

c.培養基成分不適合其大量表現，可能因營養需求不同。

c. 本身菌類生長方式不同：

例如病毒為絕對寄生菌，無法在一般培養基中培養。

E、依其植物棲息的地方分為：

1. 植物表面棲息的菌類 如：細菌，真菌。

2. 在植物內部共生寄生的菌類： 如：病毒，類病毒，細菌，真菌，菌質體。

3. 在大氣中游移的菌種 細菌，真菌，蹣。

三、污染種類的鑒定方式

1. 針對培養難易菌種鑒定方式

A、針對易培養的菌種：其種類為真菌，細菌

a.就真菌而言，主要是利用顯微鏡，視其孢子形態、產孢結構、及菌絲有無隔膜、還有細胞壁之形成加以鑒定。目前亦有使用DNA探針加以分析。

b.就細菌而言，則是利用其特殊的生化反應，或是利用選擇性的培養基。目前亦有如用fatty acid profiling技術和商業化的test kits加以鑒定。 B、不易培養的菌種，如菌質體，病毒，類病毒。

a.就菌質體而言，主要是觀察其在培養基上菌落的形態。

b.病毒而言，分析其核酸的組成與例子的外形。 類病毒因沒有套膜，以上兩種常利用其DNA有同源性而做探針偵測。

C、病原菌的偵測

利用柯霍氏法來測其病源性。而利用分子診斷，如血清、ELISA、DNA序列、核酸的探針以鑒定種類。

2. 鑒定菌種常用的方式與應用的微生物種類 方法 目標微生物 無種別性 指示培養 所有可培養的細菌 DNA/RNA 螢光染色法 菌質體及有關原核生物 Leaf dip electon microscopy 長條狀的病毒，其數目較多者亦適用 電泳 類病毒 有種別性 ELISA 細菌及病毒 PALIAS 細菌及病毒 ISEM 病毒 DNA探針 所有微生物 快速診斷的 kits 細菌 Fatty acid profiling 細菌

第七部分 植物組織培養的應用

快速繁殖優良植物株系

組織培養具有時間短、增殖率高和全年生產等優點，比大田生產快得多。加上培養材料和試管苗的小型化，這就可使有限的空間培養出大量個體。

例如蘭花(Cymbidium)、桉樹(Eucalyptus)、楊樹、秋海棠等植物，用一個莖尖或一小塊葉片為基數，經過組織培養，一年內可以增殖到10000～100000株，繁殖速度如此快，說明組織培養對于短期內需要大量繁殖的植物，如引入的優良品種、優良單株、育種過程中優良子代的擴大等，特別有用，而且對一些難以繁殖或繁殖很慢的名貴花卉、果木及稀有植物，同樣具有重要意義。

培育作物新品種

用組織培養方法培育作物新品種，已經取得了多方面的成就。例如利用組織培養解決雜交育種中的種胚敗育問題，獲得了雜種子代，使遠緣雜交得以成功;用花藥培養和對未傳粉的子房進行離體培養，獲得了單倍體植株，從而開辟了單倍體育種的途徑;通過胚乳離體培養.

獲得了三倍體植株，為改良農、林、果樹和蔬菜的三倍體育種提供了新的方法;此外還有利用原生質體培養及體細胞雜交進行天然突變系的篩選、外源遺傳物質的導入等等。

獲得無病植株

作物的病毒病害，是當前農業生產上的嚴重問題。尤其是營養繁殖的作物，病毒可以經繁殖用的營養器官傳至下一代，以致隨著作物繁殖代數的積累，病毒不僅綿延不絕，還會日益增多。其結果能使作物退化減產，甚至導致某些品種絕滅。

根據病毒在植物體內分布并不均勻的特點，用生長點進行組織培養，結合病毒鑒定，可以得到無病毒植株。這就可以使植株復壯，并能增加產量。在這方面，馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)、水仙(Narcissus tazatia L. var. chinensis Roem)、蘋果、梨(Pyrus)和花椰菜(Brassica oleracea var.bo-trytis L.)等作物，都取得了明顯效果。

保存和運輸種質

由于有了組織培養方法，就無需再用一代代保存種子的方法去保存種質資源，而可以將植物器官、組織甚至細胞，在低溫或超低溫條件下進行長期保存。將來一旦需要，就可用組織培養方法迅速進行繁殖。

這樣不但大大減少了一代代保存材料所浪費的人力、物力和時間，而且也減少了在保存過程中因管理不善及病蟲侵害所造成的損失。另外，由于用很小的空間保存了大量的種質資源，運輸時也很方便。