植物組織總RNA的提取

實驗概要

由于RNA分子的結構特點，容易受RNA酶的攻擊反應而降解，加上RNA酶極為穩定且廣泛存在，因而在提取過程中要嚴格防止RNA酶的污染，并設法抑制其活性，這是本實驗成敗的關鍵。所有的組織中均存在RNA酶，人的皮膚、手指、試劑、容器等均可能被污染，因此全部實驗過程中均需戴手套操作并經常更換（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小時以上。凡是不能用高溫烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液處理，再用蒸餾水沖凈。DEPC是RNA酶的化學修飾劑，它和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環反應而抑制酶活性。DEPC與氨水溶液混合會產生致癌物，因而使用時需小心。試驗所用試劑也可用DEPC處理，加入DEPC至0.1%濃度，然后劇烈振蕩10分鐘，再煮沸15分鐘或高壓滅菌以消除殘存的DEPC，否則DEPC也能和腺嘌呤作用而破壞RNA活性。但DEPC能與胺和巰基反應，因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理。Tris溶液可用DEPC處理的水配制然后高壓滅菌。配制的溶液如不能高壓滅菌，可用DEPC處理水配制,并盡可能用未曾開封的試劑。除DEPC外，也可用異硫氰酸胍、釩氧核苷酸復合物、RNA酶抑制蛋白等。此外，為了避免mRNA或cDNA吸附在玻璃或塑料器皿管壁上，所有器皿一律需經硅烷化處理。

細胞內總RNA制備方法很多，如異硫氰酸胍熱苯酚法等。許多公司有現成的總RNA提取試劑盒，可快速有效地提取到高質量的總RNA。                                                                                                                              

主要試劑

1. 異硫氰酸胍變性液：工作液各成分的終濃度為：

4mol/L異硫氰酸胍

25mol/L檸檬酸鈉pH 7.0

0.5%(w/v)N-十二烷基肌氨酸(Sarkosyl)

0.1mol/L巰基乙醇(2-ME)

2. 3mol/L和2mol/乙酸鈉 (NaAc) 緩沖液 (pH 4.0)

3. 水飽和酚（pH 3.5）和49∶1 (v/v) 氯仿/異戊醇

4. 4M的LiCl和70%乙醇（用DEPC處理水配制）

5. DEPC處理后高壓滅菌水                                                                                                                              

實驗步驟

1．取0.5-1g左右新鮮植物組織置于研缽中，加入液氮，迅速研磨成均勻的粉末。

2．將粉末全部移入冰上預冷的離心管中，并向其中加入3ml異硫氰酸胍變性液，輕輕搖動離心管使混合均勻。

3．順序加入2mol/l NaAc 0.3ml、水飽和苯酚3ml、氯仿/異戊醇1ml，每加入一種試劑都輕輕搖動離心管混合均勻，最后將離心管蓋緊，倒轉幾次混合均勻，冰浴15min.。

4．4℃條件下8000rpm離心15min，將上層水相轉移至另一干凈的離心管中，并加入2倍體積的無水乙醇，混勻后置于－20℃冰箱冷凍1h或更長。

5．4℃條件下8000rpm離心15min，小心去除上清液，沉淀溶于1ml 4M的LiCl，轉移至微量離心管中，4℃，13000rpm，15min。

6．棄上清，沉淀用0.4ml的DEPC水溶解，加200ul的水飽和酚和200ul的氯仿，混勻，離心，4℃，13000rpm，15min。

7. 吸取上清至新的離心管，加等體積的氯仿再抽提一次，4℃，13000rpm， 5min，吸取上清至新的離心管，加0.1倍體積的3M的NaAc和2.5倍體積的無水乙醇，－20℃1h。

8．離心棄上清，晾干后溶于適量體積（50μg/100μl）的DEPC處理水中，檢測后分裝，置于－70℃低溫條件下保存。                                                                                                                              

注意事項

RNA提取過程中，為了保證所提取的RNA的純度和完整性，其中有幾個方面的問題需要特別控制：

1.去除與RNA結合的蛋白質.

2.避免內外源Rnase對RNA的降解。在RNA的提取中，常采用的蛋白質變性劑有苯酚、氯仿、十二烷基磺酸鈉（SDS）等。為防止外源Rnase的污染，所有試驗用品均需用DEPC處理并高壓滅菌，所有試劑配制均需使用經DEPC處理過的水或滅菌處理。內源RNase的抑制采用異硫氰酸胍等強還原劑。

3.為避免人體污染，所有試驗操作均應帶手套，避免人體接觸所有用品。

4.避免在操作中說話聊天，也可以戴口罩以防止引起RNA酶污染。

5.如果您需要遠距離運輸或長期儲藏RNA樣品，建議先將標本（細胞、組織）保存在RNA保存液（RNAwait、RNAlater）中，使細胞內的RNA與RNA酶分離，在室溫可以保存7天，4℃可以保存4周，-20℃、-80℃可以長期存檔保存標本，RNA質量不受影響，用各類方法抽提仍可以獲得高質量的RNA。