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  • 發布時間:2019-08-07 17:20 原文鏈接: 植物組織蛋白質提取方法

    1、

    植物組織蛋白質提取方法(summer)

    1、根據樣品重量(1g樣品加入3.5ml提取液,可根據材料不同適當加入),準備提取液放在冰上。

    2、把樣品放在研缽中用液氮研磨,研磨后加入提取液中在冰上靜置(3-4小時)。

    3、用離心機離心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃

    4、提取上清夜,樣品制備完成。

    蛋白質提取液:300ml

    1、1Mtris-HCl(PH8) 45ml

    2、甘油(Glycerol)75ml

    3、聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpolypyrrordone)6g

    這種方法針對SDS-PAGE,垂直板電泳!

    2、

    植物組織蛋白質提取方法 (summer)

    三氯醋酸—丙酮沉淀法

    1、在液氮中研磨葉片

    2、加入樣品體積3倍的提取液在-20℃的條件下過夜,然后離心(4℃8000rpm以上1小時)棄上清。

    3、加入等體積的冰浴丙酮(含0.07%的β-巰基乙醇),搖勻后離心(4℃8000rpm以上1小時),然后真空干燥沉淀,備用。

    4、上樣前加入裂解液,室溫放置30分鐘,使蛋白充分溶于裂解液中,然后離心(15℃8000rpm以上1小時或更長時間以沒有沉淀為標準),可臨時保存在4℃待用。

    5、用Brandford法定量蛋白,然后可分裝放入-80℃備用。

    藥品:

    提取液:含10%TCA和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮

    裂解液:2.7g尿素0.2gCHAPS溶于3ml滅菌的去離子水中(終體積為5ml),使用前再加入1M的DTT65ul/ml。

    這種方法針對雙向電泳,雜質少,離子濃度小的特點!當然單向電泳也同樣適用,只是電泳的條帶會減少!

    3、

    組織:腸黏膜 (newinbio)

    目的:WESTERN BLOT檢測凋亡相關蛋白的表達

    應用TRIPURE提取蛋白質步驟:



    含蛋白質上清液中加入異丙醇:(1.5ml每1mlTRIPURE用量)

    倒轉混勻,置室溫10min

    離心:12000 g,10min,4度,棄上清

    加入0.3M鹽酸胍/95%乙醇:(2ml每1mlTRIPURE用量)

    振蕩,置室溫20min

    離心: 7500g,5 min,4度,棄上清

    重復0.3M鹽酸胍/95%乙醇步2次

    沉淀中加入100%乙醇 2ml

    充分振蕩混勻,置室溫20 min

    離心: 7500g,5min,4度,棄上清吹干沉淀

    1%SDS溶解沉淀

    離心:10000g,10min,4度

    取上清-20度保存(或可直接用于WESTERN BLOT)

    存在的問題:加入1%SDS后沉淀不溶解,還是很大的一塊,4度離心后又多了白色沉定,SDS結晶?測濃度,含量才1mg/ml左右。

    解決:提蛋白試劑盒,另外組織大小適中,要碎,立即加2X BUFFER,然后煮5-10分鐘,效果很好的。

    5、

    植物材料:水稻苗,葉鞘,根(ynibcas)

    1、200毫克樣品置于冰上磨碎

    2、加lysis buffer,離心,10000rpm,4度,5min取上清

    3、重復離心5min

    lysis buffer:urea np-40 ampholine 2-me pvp-40

    6、

    蛋白質樣品制備(sigma)

    秧苗蛋白質樣品的提取按Davermal等(1986)的方法進行。

    100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂,用液氮研磨成粉,加入1.5 ml 10% 三氯乙酸(丙酮配制,含10mM即0.07%β-巰基乙醇),混勻,-20℃沉淀1小時,4℃,15000 r/min離心15 min,棄上清,沉淀復溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巰基乙醇),再于-20℃沉淀1小時,同上離心棄上清,(有必要再用80%丙酮(含10 mMβ-巰基乙醇所得沉淀低溫冷凍真空抽干。

    按每mg干粉加入20μl(可調) UKS液[9.5 M尿素,5mM碳酸鉀,1.25%SDS,0.5%DTT(二硫蘇糖醇),2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc,pH3.5-10),6% Triton X-100],37℃溫育30min,期間攪動幾次,28度 (溫度低,高濃度的尿素會讓溶液結冰)16000 r/min離心15 min,離心力越大時間長一點越好!上清即可上樣電泳。或者-70度保存

    7、

    植物根中蛋白質的抽取(phenol)

    (1) sample, 液氮研磨

    (2) 裝1.5 ml centrifuge 用tube

    (3) 加 1M KH2PO4+K2HPO4 700 ul

    (4) 12000 rpm, 4度, 10-15minite

    (5) 取上層液,蛋白質就在里面

    8、

    材料:細菌蛋白(puc18)

    用甲醇提取的,凍干后用緩沖液溶解的。樣品緩沖液是一般的。其中含又2%的SDS,20mmol的2-巰基乙醇。

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