植物組織ATP酶活性測定

一、原理
ATP酶（adenosinetriphosphatase）可催化ATP水解生成ADP及無機磷的反應，這一反應放出大量能量，以供生物體進行各需能生命過程。它存在于生物細胞的多個部位，比如細胞質膜上，葉綠體  類囊體膜上，對整個生命的維持有著重要的作用。在生物學研究中，常通過測定酶促反應釋放的無機磷量或ATP的減少量以及pH變化等來測定ATP酶的活力。本實驗通過測酶促反應過程中無機磷的釋放量來測定葉綠體偶聯因子ATPase的活力。偶聯因子是分布在葉綠體類囊體膜表面的一種復合蛋白，它在光合作用能量轉換反應中起重要作用。在正常情況下，膜上的偶聯因子催化光合磷酸化反應（ATP合成）的速率很高，而水解ATP的活力是十分低的，但用二硫蘇糖醇（DTT）、胰蛋白酶或較高溫度等激活后，它水解ATP的活力可大大增加。因此，偶聯因子的測定常用激活后的ATPase水解ATP的活力來表示。

二、材料、儀器設備  及試劑
（一）材料：新鮮菠菜10g，洗凈，去葉柄和中脈備用。
（二）儀器設備：1．分光光度計  ；2．水浴鍋；3．照光設備（光源50，000Lx）；4．臺式離心機。
（三）試劑：1. Tris-HCl緩沖液1mol/L（pH8.0）：稱60.57g Tris溶于400ml蒸餾水中，用濃鹽酸調至pH8.0，再加蒸餾水至500ml。2. 5mol/L 硫酸溶液：取27.8ml（比重1.84）濃硫酸，慢慢加入到70ml蒸餾水中，冷卻后定容至100ml。3. 10％硫酸鉬酸銨溶液：稱10g鉬酸銨溶于100ml5mol/L 硫酸中。4. 硫酸亞鐵－鉬酸銨試劑：稱5g硫酸亞鐵，加入10ml硫酸鉬酸銨，再加蒸餾水稀釋到70ml，直至溶解為止（用前臨時配制）。5. STN緩沖液，將0.05mol/L Tris-HClpH7.8緩沖液（內含0.4mol/L 蔗糖、0.01mol/L NaCl)放入冰箱中預冷。

三、實驗步驟
（一）葉綠體制備及葉綠素含量測定：取準備好的菠菜葉5g，置于研缽或組織搗碎機杯中，加入20ml0℃下預冷的STN緩沖液，很快研磨或搗碎（0.5min完成），作成勻漿，以四層紗布過濾去粗渣，濾液于0～2℃下，200×g離心約1min，去細胞碎片，將上清液再于1500×g離心5～7min，取沉淀懸浮于少量STN（pH7.8）中，使葉綠素含量在0.5mg/ml 左右。小麥、水稻均可以此介質制葉綠體。如以甜菜葉子作材料，則勻漿介質中還應加入0.02mol/L 抗壞血酸鈉。一般取0.1ml葉綠體，加0.9ml水和4ml丙酮（分析純），離心，取上清液于652nm測吸光度，按Arnon公式計算：葉綠素含量＝A652×1000×5/(34.5×1000×0.1)＝A652×1.45mg/ml
（二）ATP酶的激活：1. Mg2+-ATP酶激活液及反應液配制：2. 激活過程：取已制備好的葉綠體懸浮液1ml（葉綠素含量約為0.1mg/ml），加入1ml激活液，于室溫在白熾光50000Lx下進行光激活6min。3. 反應過程：取三只試管，分別加入上述激活后的葉綠體懸浮液各0.5ml（剩下的葉綠體懸浮液供測定葉綠素含量用），再加入0.5ml的反應液，取兩管置37℃水浴中（另一管置冰浴中作空白用）保溫10min，各加入0.1ml20％的三氯乙酸停止反應。用臺式離心機離心后各取上請液0.3～0.5ml（取樣量按活力小大而改變）供測定ATP水解的無機磷用。