植物細胞的活體染色與死活鑒定

一、原理

活體染色是利用某種對植物無害的染料溶液對活細胞進行染色的技術。中性紅是常用的活體染料之一，它是一種弱堿性pH指示劑，變色范圍在pH6.4-8.0之間（由紅變黃）。

在中性或微堿性環境中，植物的活細胞能大量吸收中性紅并向液泡中排泌，由于液泡在一般情況下呈酸性反應。因此，進入液泡的中性紅便解離出大量陽離子而呈現櫻桃紅色，在這種情況下，原生質和細胞壁一般不著色；死細胞由于原生質變性凝固，胞液不能維持在液泡內。因此，用中性紅染色后，不產生液泡著色現象。相反，中性紅的陽離子，卻與帶有一定負電荷的原生質及細胞核結合，而使原生質與細胞核染色。

二、儀器與用具

顯微鏡；小培養皿；載玻片；蓋玻片；單面刀片；尖頭鑷子；酒精燈；火柴；擦鏡紙；吸水紙適量。

三、試劑

0.03%中性紅溶液；1mol/L硝酸鉀溶液。

四、方法

1. 選用洋蔥鱗莖（或大蔥假莖基部）及小麥葉片作材料。

2. 切下一片較幼嫩的洋蔥鱗片，用單面刀片在鱗片內側割劃成0.5cm²左右的小塊，用尖頭鑷子將內表皮小塊輕輕撕下，即可投入中性紅溶液染色（注意應將表皮內側向下）。若用小麥葉片為材料，可將葉片背面朝上平放在載玻片上，再將此載玻片放入盛有少量清水的培養皿內，用左手將葉片按平，右手用刀片從一個方向輕輕刮去下表皮和葉肉部分，只留下透明的上表皮細胞。當刮到只剩下少量葉肉細胞時要十分小心，用力太重容易損傷表皮細胞，甚至只剩下一層細胞壁，太輕又會留下過多的葉肉細胞，影響觀察。除小麥外其他禾本科植物也可用此法制備表皮細胞，將刮好的材料切成約0.5cm²小塊。

3. 將制好的洋蔥鱗莖內表皮或小麥葉片上表皮小塊投入0.03%的中性紅溶液中染色5~10min，取出1~2片，在蒸餾水中稍加沖洗，在載玻片上滴一滴蒸餾水，小心地將制片平展到載玻片上，加蓋玻片，在顯微鏡下觀察，可看到細胞壁被染成紅色，而原生質和液泡均不染色，這是因為蒸餾水偏酸，在弱酸性條件下細胞壁帶負電荷和染料陽離子發生吸附的結果。

4. 將步驟3中的活體染色制片取出幾片放入pH略高于7.0的自來水中浸泡10~15min，再置于載玻片上鏡檢，將發現細胞壁脫色，而液泡卻被染成深紅色，這是因為在溶液pH高于7.0的情況下，中性紅分子的解離作用很弱，主要以分子狀態存在，不易被細胞壁吸附，但較易透過質膜和液泡膜進入液泡，而植物的細胞液多呈酸性反應，進入液泡的中性紅于是發生解離，將液泡染成櫻桃紅色。此時細胞核和原生質不染色。

為了確證中性紅染色部位，可將上述洋蔥內表皮染片浸入1mol/L的硝酸鉀溶液中浸泡10min左右，然后取出觀察。由于硝酸鉀能使原生質強烈膨脹，發生“帽狀質壁分離”，因而能清楚地區別開無色透明的原生質和染成紅色的液泡。

5. 將步驟4中的活體制片放在酒精燈火焰上微微加熱，以殺死細胞，再在顯微鏡下觀察，會看到原生質凝結成不均勻的凝膠狀，與細胞核一起被染成紅色。

6. 在活體染色制片中仔細尋找，可能看到個別死細胞，其細胞核因被中性紅染色而呈紅色，清晰可辨。