植物自交不親和性測定技術

自交不親和性在白菜、甘藍等十字花科蔬菜中是普遍存在的，其遺傳機制也較相似。自交不親和株正開放花的柱頭上，如果授于同株或同系統的花粉時，柱頭就被激發產生胼胝質等物質，阻礙花粉發芽和花粉管發育，故不能正常受精結實，不結子或結少量種子；而授于別的品種或系統的花粉時，則柱頭不會被激發產生這類物質，故能正常受精結實。可是，在花蕾柱頭上，即使授于同株或同系統的花粉也不會被激發這種反應，因此可通過蕾期人工控制自交獲得自交不親和系的種子。
胼胝質是β－1、3－葡聚糖，通常分布于高等植物的篩管、新形成的細胞壁、花粉粒以及花粉管中，將其用苯胺藍染色后，在紫外光激發下，可發出黃至黃綠色的熒光。因此，把授粉后經用苯胺染色的子房放到熒光顯微鏡  下觀察，可看到花粉在柱頭上萌發、花粉管發育的狀態，以及胼胝質在柱頭表面的沉積狀況等，進行判斷花粉與柱頭是否親和。
實驗目的是學習花期人工控制自交測定選擇自交不親和系和蕾期自交繁殖自交不親和系的方法；掌握用熒光顯微鏡檢測植物  的自交不親和性技術；通過本實驗加深對自交不親和系選育過程的理解。

一、試材及用具
1．試材：白菜、甘藍、蘿卜等十字花科正開花的種株。
2．用具：熒光顯微鏡、廣口瓶（20～50ml）、載玻片、蓋玻片、鑷子、鉛筆、紙牌、紙袋、細鐵絲、細竹竿、脫脂棉、甲醛、冰醋酸、無水酒精、普通酒精、磷酸鉀、苯胺藍、氫氧化鈉、甘油、蒸餾水等。
二、方法步驟
（一）人工自交測定法
1．每人選3～5株發育健壯已開花的種株，每株上選3～4個花序。將其上已開的花和角果摘除，然后套上隔離紙袋，把袋口用細鐵絲扎緊防止昆蟲進入，于植株旁插一細竹竿，用繩把紙袋綁到細竹竿上保持固定，防止花序被風吹斷，并在竹竿上掛一紙牌作標記。
2．2～3d以后，當每個花序上有10朵左右花開放時，解除紙袋，將已開的花和蕾之間綁一條線作為區分標記，同時在每個花序上選擇10個左右大蕾，把其余的小蕾用鑷子去掉，并用鑷子把花蕾頂端的花被去掉一部分使柱頭露出，切勿傷害柱頭。再用鑷子摘取本株隔離袋內已開花的花藥，把花粉同時抹到已開的花和破蕾的柱頭上，進行人工花期和蕾期自交。授粉完畢，于每個花序下面掛上紙牌，注明花期自交花數，蕾期自交蕾數，授粉者姓名和授粉日期。最后用紙袋按原來的套袋隔離方法進行套袋隔離。
3．授粉2～3d后要及時提袋，防止花序于袋內頂彎或折斷。在暴風雨后，要及時檢查，如發現被風吹雨打破裂的隔離袋要及時修補或更換，被風吹倒了的植株要輕輕扶起來加以重新固定，切防折斷。
4．在授粉后7～10d花瓣脫落之后，可將隔離袋摘除，去掉多余花枝及后來陸續抽出的花枝，確保花序的發育。以后除按一般種株管理之外，應特別注意防止蚜蟲、霜霉病等病蟲害。
5．當角果變黃后，可把角果帶花枝剪下裝入紙袋，拿到室內風干考種（表1－5）。


（二）熒光鑒定法
1．預先配制幾種試劑
（1）FAA固定液：將40%甲醛、80％酒精和冰醋酸，按1:8:1的比例配制而成。
（2）卡諾固定液：用3份無水酒精和一份冰醋酸配制而成。
（3）0.1N磷酸鉀水溶液：稱取71g磷酸鉀，用蒸餾水定容至1000ml。
（4）0.1%苯胺藍溶液：稱取0.1g水溶性苯胺藍，用0.1N磷酸鉀水溶液定容至100ml。
（5）8N氫氧化鈉溶液：稱取32g氫氧化鈉，用蒸餾水定容至100ml。
2．取樣、固定和保存
解開人工控制自交授粉6～12h的花枝上的紙袋，摘取子房，于花柱基部切下花柱，將花期授粉和蕾期授粉的花柱分別固定于FAA固定液或卡諾固定液中，24h后，轉移到70%酒精溶液中保存。在瓶上注明株號、花期授粉還是蕾期授粉處理以及試驗者姓名。
3．透明和軟化
將上述固定材料用水沖洗后，轉移到指形管中，用8N氫氧化鈉浸泡8～24h。
4．染色
把軟化后的試材用自來水多次換水浸泡1h以上，除去大部分氫氧化鈉之后，轉移到0.1%苯胺藍染液中染色4h左右。
5．觀察
用鑷子挑取一枚染色后的花柱，放在載玻片上，用濾紙吸出染液，滴上一滴甘油，蓋上蓋玻片，輕輕敲壓蓋玻片，使花柱展開。然后把載玻片放到熒光顯微鏡下，觀察記載每株柱頭胼胝質沉積狀況，花粉萌發及花粉管生長狀態。

三、作業思考題
1．按照上表中的數據資料，統計每株的親和指數，即親和指數＝每株結籽粒數/每株花期自交花數，并將資料進行合理分析。
2．根據花期自交和蕾期自交柱頭胼胝質沉積情況以及花粉管生長狀況，判斷取樣株自交親和與否，繪出親和株和不親和株花粉發芽以及生長狀態圖。
3．本實驗采用的第一種方法中，有哪些技術環節使可以變化的？
4．花期人工控制自交測定自交不親和性產生誤差的原因有哪些？