試劑、試劑盒
| 儀器、耗材 | |
|---|---|
| 實驗步驟 | 3.1 第一向：在 IPG 膠條中進行等電聚焦（ IPG-IEF) 采用 IPG ( IPG-Dalt ) 的雙向電泳技術的第一向，等電聚焦（IEF) 是采用獨立的，3 mm 寬的，附著在 GelBond PAG 支持膜上的 IPG 膠條進行的。目前已有 7cm、11cm、18cm 和（或）24 cm 長的幾乎所有需要的 pH 范圍的預制 Immobiline 干膠條。例如，寬 pH 范圍的 IPG 3~10 和 IPG 3~11，中等 pH 范圍的 IPG 4~7 或 IPG 6~9 , 窄 pH 范圍的 IPG 4~5 或 IPG 4.5~5.5 ( 如 GE Healthcare，Bio- Rad，Sigma- Aldrich，Serva) 。或者也可使用實驗室自制 IPG 干膠條。關于 IPG 灌制的細節，有興趣的讀者可以參考之前發表的方法 [21] 。 在進行 IEF 之前，需要水化 IPG 干膠條，然后再將膠條置于水平等電聚焦儀的冷卻盤上 [13，22] 。最近，一種 叫做 IPGphor 的整體系統的使用簡化并加速了 IPCMEF。這種儀器的特點有：在持膠槽中水化單獨的 IPG 干膠條或在水化同時上樣，可以選擇杯上樣，使用高電壓（8000V ) 進行后續 IEF，在 IPG 干膠條放入陶瓷持膠槽后無需再對其進行操作。 當使用 pH 大于 9 的 IPG 膠條時，DTT 的消耗會導致堿性端的水平漂移。為消除漂移，在膠條的水化液中，可用二硫代羥乙基（HED) (DeStreak，GE Healthcare ) 代替 DTT 等還原劑來保持半胱氨酸中二硫鍵的穩定。除了能去除漂移外，使用 HED 使點更清晰并提髙重復性 [23] 。而且，使 用 IPGphor，可使如核糖體和核蛋白等等電點大于 10 的極端堿性蛋白的等電聚焦得到大大的簡化。 1. IPG 膠條的水化和上樣 在進行 IEF 之前，IPG 干膠條必須在水化盒或水化盤中水化至其原始厚度 0.5 mm。IPG 干膠條可用溶解有樣品的水化液進行水化（水化上樣 ) [24] 或用不含樣品的水化液進行水化，然后再用杯上樣的方法上樣。雖然水化上樣更方便，但在樣品含有高分子質量( < 100 kDa) ，極端堿性和（或）極端疏水的蛋白質時不推薦使用這種方法。這是因為這些蛋白質不易進入膠內。其原因可能是蛋白質和水化盤壁之間的疏水互作或凝膠基質孔徑的限制作用。如果樣品體積顯著地超出 IPG 膠條水化后預計達到的體積，后一種現象就特別明顯。高分子質量蛋白質更可能留在多出的水化液中而不是進入 IEF 膠中。交叉污染也是一個問題，因此水化盤在不同次實驗之間必須徹底清洗。總之，水化上樣不如杯上樣可靠，特別是在定量實驗中。 在杯上樣中，IPG 干膠條仍舊用水化液水化。IPG 膠條水化后，將溶解在裂解緩沖液中的樣品（20~100 μl ) 加 入在 IPG 膠條表面上的一次性塑料或硅膠杯中（見注釋 3)。將樣品加在 pH 極端位置時效果最好，也就是靠近陰極或陽極。大多數情況下在陽極附近上樣比在陰極附近上樣更好。當使用堿性 pH 梯度，如 IPG 6~12 或 9~12，所有樣品都必須從陽極上樣 [15~17] 。 單根 IPG 膠條的蛋白質上樣量由幾個因素決定。按照經驗：分離距離越長（也就是膠條越長），pH 梯度范圍越窄，蛋白質檢測方法越不靈敏，則所需蛋白質越多。20 cm X 20 cm 的分析用（銀染）雙向電泳凝膠的推薦上樣量為 50~100 μg，微量制備凝膠的推薦上樣量多至 1 mg ( 或更多）。當使用非常窄的 pH 范圍的 IPG 膠條時，我們強烈建議僅使用預分離后的樣品 [ 25 ] 。 1 ) 用水化盤水化 IPG 干膠條 ( 1 ) 如果在水化的同時上樣 [24]，則直接將細胞裂解產物或組織樣品（5~10 mg 蛋白質/ml ) 溶解至適量的 IPG 干膠條水化液中。水化 180 mm 長、3 mm 寬的膠條時，可吸取 350 μl 上述溶液置于 IPG 干膠條水化盤中的凹槽中（圖 13-2)。如 IPG 膠條更長或更短，水化液體積需要進行相應換算（如 240 mm 長的 IPG 干膠條用 450 μl) 。 ( 2 ) 從 IPG 干膠條表面撕去保護膜，將 IPG 膠條膠面朝下放入凹槽中，同時避免產生氣泡。然后用 IPG 干膠條覆蓋油覆蓋 IPG 膠條（避免水化時膠條變干）。覆蓋前膠條應能夠活動且沒有粘在水化盤上。覆蓋后在約 20°C 條件下過夜水化 IPG 膠條。溫度過高（ > 37°C ) 有氨基甲酰化的危險，而溫度過低（< 15°C ) 會導致尿素在 IPG 膠中結晶。 ( 3 ) 如果使用杯上樣，則將 IPG 干膠條用沒有樣品的水化液在水化盤中仍舊按上述第二步的方法過夜水化。 2 ) 用 IPGphor 持膠槽水化膠條并同時上樣 ( 1 ) 用樣品溶解緩沖液（也就是尿素/硫脲裂解緩沖液）溶解蛋白質并用 IPG 干膠條水化緩沖液稀釋提取液。 ( 2 ) 將所需數量的 IPGphor 持膠槽（圖 13-2) 置于 IPGphor 的冷卻盤/電極區域。 ( 3 ) 吸取 350 μl 溶有樣品的水化液（使用 180 mm 長 的 IPG 膠條時）放入持膠槽底部。 ( 4 ) 由 IPG 膠條上去除保護膜，然后緩慢地將 IPG 膠條（膠面朝下）放入水化液中。避免產生氣泡。膠條應仍然能夠活動且沒有粘在水化盤上。用 1~2 ml IPG 干膠條覆蓋油覆蓋 IPG 膠條然后蓋上塑料蓋。按壓在蓋子下的支撐塊以確保 IPG 膠條在水化時與電極保持良好接觸。水化時加低電壓（30~50 V ) 以使高分子質量蛋白質更好地進入膠內 [15，28] 。  2. 在平板儀器上進行 IPG-IEF ( Multiphor ll Unit) 滿足下列條件時，水化后的 IPG 膠條可以直接放在 IEF 儀器的冷卻板上：① 如果運行時間不超過 12 h ( 經常發生在寬的或中等 pH 范 圍 IPG，如 IPG 3~10 或 4~7 ) 。② 如果 pH 梯度不超 過 pH 10. 0。③ 如果只用杯上樣的方法加很小體積的樣品 ( 20 μl ) [ 3，22 ]。使用 Immobiline 干膠條試劑盒中的上樣杯更方便進行大體積的樣品上樣( 直至 100 μl )。當用干膠條試劑盒進行 IEF 時，IPG 膠條可以用硅樹脂油或干膠條覆蓋油覆蓋。當樣品為極端堿性（pH > 10.0 ) 蛋白質或用窄 pH 梯度（ pH 范圍< 1 單位）進行微量制備電泳時必須用覆蓋油等覆蓋；而當 pH 范圍較寬且 pH 梯度不超過 pH 10.0 ( 如 IPG 4~7 或 3~10 ) 時，使用干膠條試劑盒時可不加覆蓋油。 ( 1 ) 將冷卻盤放入 Multiphor ll 電泳儀中。吸取 3~4 ml 煤油或 IPG 干膠條覆蓋油加在冷卻盤上，然后將 Immobiline 干膠條盤放在冷卻盤上（圖 13-2)。在膠條盤和冷卻盤之間避免產生氣泡。 ( 2 ) 將膠條盤上的電極連至 Multiphor II 電泳儀上。 ( 3 ) 將 10 ml 左右的 IPG 干膠條覆蓋油或硅樹脂油注入膠條盤中，將波紋狀的 Immobiline 膠條標尺放在膠條盤中的覆蓋油的頂端。 ( 4 ) IPG 膠條水化后（見 13. 3.1 節 1.1)，用干凈的鑷子從水化盤中取出水化好的 IPG 膠條。用去離子水沖洗膠條，然后將膠條放在兩層濕潤的濾紙之間，用濾紙吸膠條上多余的覆蓋油幾秒。這樣能夠防止 IEF 過程中尿素在膠表面結晶。轉移水化后的 IPG 膠條（膠面朝上且酸性端對準陽極）放入槽中并靠近標尺。排列 IPG 膠條并保證對著陽極的膠條邊緣排列整齊。 ( 5 ) 切取兩條 IEF 電極條（GE Healthcare ) 或由厚 2 mm 的濾紙（如 MN440，Macherey Nagel，Germany ) 制成的濾紙條，其長度為所有 IPG 膠條在膠條盤中排列的相應寬度。用去離子水浸泡電極條，再用濾紙吸走多余液體，然后將濕潤的 IEF 電極條放在排列整齊的膠條的陰極和陽極附近。 ( 6 ) 將電極放在 IEF 電極條上并輕輕向下按壓電極。 ( 7 ) 如果樣品已經在水化時進入膠條，則用約 80 ml 干膠條覆蓋油覆蓋膠條，然后轉至第 12 步。如果用杯上樣方法，則繼續第 8 步。 ( 8 ) 將上樣杯放入上樣杯槽中，但要避免接觸膠條表面。而且，確保上樣杯與陽極 ( 或陰極，如果使用陰極上樣）之間有幾毫米的距離。 ( 9 ) 將上樣杯移動至合適位置，每個膠條上一個上樣杯，然后輕輕向下壓上樣杯。上樣杯要和膠條緊密接觸但不能損壞膠條表面。 ( 10 ) 放好上樣杯之后，向膠條盤中注入約 80 ml 的干膠條覆蓋油以完全覆蓋 IPG 膠條。如果覆蓋油漏入上樣杯，吸出覆蓋油，重新調整上樣杯，再次檢查是否漏液。在每個上樣杯中加入幾滴干膠條覆蓋油。如果使用 pH 為 3~ 10 的寬 pH 梯度進行 IEF，加覆蓋油這一步可以省略。 ( 11 ) 吸取樣品并加人覆蓋油下的上樣杯底部。再次檢查是否漏液。 ( 12 ) 關閉等電聚焦箱的蓋子，根據表 13-1中的參數開始電泳。為使樣品更好地進入膠內，最初幾小時的電壓應被限制在 150V 、300V、600V。然后用最大電壓 3500V 電泳至穩態（見注釋 4) 。電流限制在 0.05 mA/IPG 膠條。最佳聚焦溫度是 20°C [ 26] 。 ( 13 ) 當 IEF 結束后，從膠條盤中取出電極、上樣杯槽和 IEF 電極條。用干凈的鑷子從膠條盤中取出 IPG 膠條。如果 IPG 膠條不被立刻用來進行第二向電泳和（或）用來進一步研究，可將它們夾在兩層塑料膜之間貯存在 -70°C，可貯存數月。   3. 使用 IPGphor 電泳儀進行 IPG-IEF 使用一種叫做 IPGphor ( GE Healthcare，最近 Bio-Rad 也開發出一套類似的系統）的整體系統可使雙向電泳中的 IPG-IEF 簡化 IPGphor 包括一個可精確控溫（在 19.5~20.5°C ) 的 Peltier 元件和一個可編程的電源。這個儀器的核心部分是不同長度的（7cm、11cm、13cm、18cm 或 24cm) 氧化鋁陶瓷制的細槽，被稱為持膠槽。IPG 膠條可在持膠槽中水化并同時上樣，然后進行 IEF。當膠條被放入持膠槽后，后續步驟無需對膠條進行進一步操作（圖 13-2)。IPGphor 是可編程的，而且最多可以存儲 10 組不同程序。該儀器支持延遲啟動，這使得使用者可以在下午在持膠槽中用含有樣品的水化液水化膠條，然后晚上 IEF 自動啟動并在第二天早上結束。 當在堿性 pH 范 圍內（＞ pH 10.0 ) 進行蛋白質分離時，用杯上樣的方法單獨對不同的水化好的 IPG 膠條上樣比用水化上樣的方法上樣得到的分離效果好得多。可以使用特殊杯上樣（“ 通用” ）IPGphor 持膠槽，或復合式杯上樣持膠槽（“ 復合式” ）進行樣品的杯上樣（圖 13-2)。杯上樣最多允許上 100 μl 樣品（見注釋 3) 。持膠槽平臺能夠調節溫度并能將持膠槽與電源連接。除了操作簡單外，IPGphor 的另一個優勢是聚焦時間短。這是因為用 IPGphor 能在很髙的電壓下（最高 8000 V ) 進行 IEF。 使用 IPGphor 進行 IEF 的典型工作條件見表13-2和 表 13-3 。正如前文指出的那樣 ，為了使高分子質量的蛋白質更好地進入聚丙烯酰胺膠內，水化時應在膠條兩端加低電壓（30~50 V ) ，否則將給水化上樣造成困難[ 15，28] 。然后電壓逐步升高至 8000 V。如果 IPG 膠條的分離長度 < 11 cm，電壓應限制在 5000 V 內。為在分離含鹽量高的樣品或使用窄 pH 間隔分離樣品時得到最佳效果，在電壓升髙至 8000 V 之前可在電極和 IPG 膠條之間墊上濕潤的濾紙片（尺寸：4mm X 4mm) ( 見注釋 4 ) 。當 IEF 結束后，按13. 3.1 節 2. 第 13 步中的方法貯存 IPG 膠條。    1 ) 水化上樣 IEF ( 1 ) 將所需數量的持膠槽放在冷卻盤或 IPGphor 的電極區（圖 13-2 ) 上。吸取適量 （如 180 mm 長 IPG 膠條吸取 350 μl）的含有樣品的 IPG 干膠條水化液注入持膠槽中，將 IPG 膠條膠面朝下放入水化液中，然后用 IPG 干膠條覆蓋油覆蓋。具體方法見 13. 3.1 節 1. 2) 。 ( 2 ) 設置 IPGphor ( 所需的水化時間、伏小時、電壓梯度）。 ( 3 ) IPG 膠條水化后（至少需要 6 h，通常過夜），按表 13-2 所列參數開始 IEF。 ( 4 ) IEF 完成后，將那些不立刻進行第二向電泳的 IPG 膠條夾在兩層塑料膜之間貯存于 -70°C。 2 ) 杯上樣 IEF ( 1 ) 在水化盤中用不含樣品的水化液水化 IPG 干膠條。IPG 膠條水化后，用干凈的鑷子將水化好的 IPG 膠條從水化盤或水化盒中取出。用去離子水沖洗膠條，然后將膠條放在兩層濕潤的濾紙之間，用濾紙吸膠條上多余的覆蓋油幾秒。這樣能夠防止 IEF 過程中尿素在膠表面結晶。見 13. 3.1 節 2. 。 ( 2 ) 將所需數量的杯上樣持膠槽放在冷卻盤或 IPGphor 的電極區上，確保持膠槽的尖端（陽極）與電極區的陽極區相連。可以使用復合式持膠槽代替獨立持膠槽。 ( 3 ) 將水化好的 IPG 膠條放入杯上樣持膠槽（或復合式持膠槽）中，膠面朝上且膠條尖端（酸性端）對準陽極。確保 IPG 膠條的陰極距離槽的末端約 1.5 cm 且通過電極絲與電極連通。 ( 4 ) 用去離子水潤濕兩張電極濾紙墊片（尺寸：4 mmX10 mm) ，用濾紙吸掉過多的去離子水，然后將潤濕的電極濾紙墊片放在陽極和陰極電極與 IPG 膠條之間 IPG 膠條的表面上。如果必要（如當樣品含鹽量高），數小時后可以更換新的濾紙墊片。 ( 5 ) 將活動電極放在電極濾紙墊片上。夾緊電極使其緊壓電極濾紙墊片。 ( 6 ) 將可移動的上樣杯放在陽極或陰極附近，然后輕輕將上樣杯壓在 IPG 膠條表面上。上樣杯應與 IPG 膠條緊密接觸但不能損傷膠條表面。 ( 7 ) 為確保上樣杯不漏液，向杯中加入 100 μl IPG 覆蓋油。如發現漏液，除去覆蓋油并用綿紙吸凈覆蓋油，然后重新放置上樣杯。再次檢查是否漏液。上樣前吸出覆蓋油。 ( 8 ) 每根膠條用 2~4 ml IPG 膠條覆蓋油覆蓋（建議不要使用硅樹脂油或煤油替代 IPG 膠條覆蓋油）。萬一覆蓋油漏入上樣杯，重新放置上樣杯并用綿紙吸凈杯中的覆蓋油。再次檢查是否漏液，然后吸取樣品（20~100 μl ) 加入上樣杯。 ( 9 ) 設置儀器（所需伏小時、電壓梯度、溫度等）并按表 13-2 和表 13-3 中推薦的參數進行 IEF。省去表 13-2中為水化上樣推薦的低電壓水化步驟。 ( 10 ) IEF 完成后，繼續進行平衡或第二向 IEF ( SDS-PAGE ) ( 見 13.3.3 節），或將 IPG 膠條夾在兩層塑料膜之間貯存于 -70°C，可貯存數月。 3.2 IPG 膠條平衡 在進行第二向分離（SDS-PAGE ) 之前，平衡 IPG 膠條使膠條中分離的蛋白質與 SDS 充分作用十分重要。由于與載體兩性電解質凝膠相比，聚焦后的蛋白質與 IPG 膠條的結合更加緊密，因此需要相對長的平衡時間（10~15 min) 以及尿素和甘油來改善蛋白質在第一向和第二向之間的轉移效果。其中尿素和甘油可以減輕電滲作用的影響。目前最常用的步驟是將 IPG 膠條在一種最初由 Gorg 等 [13] 提出的緩沖液 [ 50 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.8) 、2% (m/V ) SDS、1% ( m/V）DTT、6 mol/L 尿素、30% (m/V) 甘油；表 13-4 中平衡 10~15 min。然后再將膠條在把上述緩沖液中的 DTT 換成 4% ( m/V ) 碘乙酰胺后形成的緩沖液中進一步平衡 10~15 min。后面的步驟是用來烷基化游離的 DTT，否則 DTT 會在第二向 SDS-PAGE 膠中遷移，從而導致點拖尾現象。該現象在銀染之后就會被觀察到。更重要的是，碘乙酰胺會烷基化巰基并阻止它們的氧化還原作用。我們強烈推薦使用這種還原/烷基化兩步程序，這是因為它能夠相當程度上簡化后續質譜鑒定的樣品制備工作（膠內消化蛋白質）。平衡后，IPG 膠條被放在第二向水平或垂直 SDS-PAGE 膠的表面。 ( 1 ) 溶解 100 mg DTT ( Sigma-Aldrich ) 至 10 ml 平衡液中以配制平衡液 I 。 a. 為每根膠條準備 10 ml。 b. 將每根聚焦后的膠條放入一個試管（250 mm 長 ，內徑 20mm) 中，在每個試管中加入 10 ml 平衡液 I 。 c. 試管用 Pamfilm 密封后在搖床上搖動 15 min，然后倒出平衡液。也可使用較短的平衡時間（10 min) ，不過這樣做的風險是在樣品進入 SDS-PAGE 膠時一些蛋白質可能不會從 IPG 膠條中出來。如果這樣，應當在把 IPG 膠條從 SDS 膠上取下后將 IPG 膠條染色，以檢查是否所有的蛋白質離幵了 IPG 膠條。 ( 2 ) 溶解 0.4 g 碘乙酰胺（Sigma- Aldrich) 至 10 ml 平衡液中以配制平衡液 Ⅱ。 a. 為每根 IPG 膠條準備 10 ml。 b. 向每根膠條加入 10 ml 平衡液Ⅱ和 50 μl 作為 SDS-PAGE 指示劑的溴酚藍（Serva) 溶液，再次輕輕搖動平衡 15 min。 ( 3 ) 倒出平衡液Ⅱ，進行 SDS-PAGE ( 見 13.3.3 節）。如果用水平電泳槽（ 如 Muhiphor Ⅱ ) 進行 SDS-PAGE ，用去離子水短暫地沖洗 IPG 膠條，然后將膠條放在一張濾紙的一邊，等待幾分鐘以吸凈多余的平衡液。如果用垂直電泳槽（如 EttanDalt ) 進行 SDS-PAGE，用電極緩沖液短暫地沖洗 IPG 膠條。  3.3 第二向：多重垂直 SDS-PAGE SDS-PAGE 可以在水平或垂直系統上進行 [29] 。水平設備適用于預制膠（ExcelGel SDS；Amersham Biosciences/ GE Healthcare) 。而垂直系統則應用于多塊膠平行進行的電泳中，尤其是大規模的蛋白質組分析中。這種分析通常需要同時進行數批第二向 SDS-PAGE 電泳以達到更高的通量和最好的重復性 [31] 。 1. 灌制 SDS 膠 ( 1 ) 灌膠膠板（200 mm X 250 mm) 由兩塊書本形狀的 3 mm 厚的玻璃板組成。兩塊玻璃板用一根鉸鏈條連接，玻璃板之間有兩條 1 mm 厚的邊條。將 14 塊膠板垂直堆入 Ettan Dah II 的灌膠模具中。堆疊時鉸鏈條朝右，膠板之間用塑料分隔片（如 0.05 mm 厚聚酯片）分隔。 ( 2 ) 將灌膠模具的前板放好，旋上螺帽（用手擰緊）（圖 13-2)。 ( 3 ) 用環架將一個漏斗支撐在灌膠模具頂端上方約 30 cm 處，用一根聚乙烯管（內徑 5 mm ) 與之連接。管的另一頭與灌膠模具一邊的側室上的金屬接口相連。 ( 4 ) 向側室中灌入 100 ml 指示劑。 ( 5 ) 在即將灌膠之前，在凝膠溶液中加入 TEMED 和過硫酸氨溶液（表 13-5)。灌膠時，將凝膠溶液（830 ml) 注入漏斗。管中避免產生氣泡。不要用丙烯酰胺溶液將膠板灌滿。這是由于用熱瓊脂糖將 IPG 膠條固定在 SDS 膠頂端時需要一定的空間（約 10 mm)。 ( 6 ) 當溶液注入之后，將管從側室接口上取下。此時側室中指示劑的水平面會下降。 ( 7 ) 小心地向每塊膠的頂端加入約 1 ml 覆蓋液以使膠面平整光滑。 ( 8 ) 讓凝膠在約 20°C 聚合至少 3 h，為獲得更好的重復性，最好過夜聚合。 ( 9 ) 膠聚合后，將灌膠模具的前板取下，小心地從模具中取出膠板。可用刀片將膠板分開。將膠板之間的分隔片取下。 ( 10 ) 用水清洗膠板以除去膠板外表面的丙烯酰胺，然后將多余液體從膠上端排出。由于電泳一次只能用掉 12 塊膠板，應丟棄不理想的膠板，尤其是厚度不均勻的膠板。通常是外側的膠板。 ( 11 ) 如果聚合好的凝膠不被立即使用，可將它們用塑料包好貯存在冰箱中（4°C )。最長可貯存 2 天。  2. 使用 Ettan Dalt II 垂直電泳槽進行多重 SDS-PAGE ( 1 ) 向 Ettan Dalt II 電泳槽下槽中加入 1875 ml 電極緩沖液儲液和 5625 ml 去離子水。混合并打開冷卻器（25°C)。 ( 2 ) 將 DALT 膠板（內有 SDS 凝膠）垂直放置在膠板架上以便放上 IPG 膠條。 ( 3 ) 用電極緩沖液（用水 1 : 1 稀釋）短暫沖洗平衡好的 IPG 膠 條，將膠條放在 DALT 膠板頂端。 a. 用薄刮刀或尺子推 IPG 膠條背后支持膜，使膠條進入兩層玻璃板之間的空隙中。 b. 加入 2 ml 熱（75°C ) 瓊脂糖溶液，繼續將膠條向下推向 SDS 膠表面直到兩者緊密接觸。IPG 膠條和 SDS 膠表面之間避免產生氣泡。 c. 如需在電泳同時加入分子質量標準蛋白質，可用 5 μl 溶有 SDS 標準蛋白質的電極緩沖液浸泡一張濾紙片（2~4 mm2 ) 。弄干濾紙片后將其放在 IPG 膠條的左側或右側。 d. 干燥后的溶有分子質量標準蛋白質的濾紙片可放在微量離心管中貯存于 -70°C。 ( 4 ) 在將膠板放入電泳設備（見第 5 步）之前讓瓊脂糖凝固至少 5 min。對剩余 IPG 膠條重復上述步驟。雖然將膠條埋入瓊脂糖并不是必須的，但這樣做能保證 IPG 膠條和 SDS 凝膠頂端結合更緊密。 ( 5 ) 將膠板浸入電極緩沖液使其外側濕潤以便放入電泳槽時更容易。將膠板插入電泳槽中。如有必要，在電泳槽中空著的狹槽中放入空的膠板。將上槽穿過膠板放好，并在其中加入 2.5L 電極緩沖液（1250 ml 儲液 + 1250 ml 去離子水) 。 ( 6 ) 蓋上電泳槽的安全蓋，并開始 SDS-PAGE。開始時以每塊膠 5 mA ( 設置最高 100V ) 跑大約 2 h。然后以每塊膠 15 mA ( 設置最高 200V ) 過夜跑大約 16 h，或更高的電流以便跑得更快（每塊膠 30 mA 大約 8 h)。 ( 7 ) 當溴酚藍蹤跡遷移出凝膠下端后終止電泳。 ( 8 ) 電泳結束后，小心地用塑料刮刀打開膠板。用刮刀將瓊脂糖從聚丙烯酰胺凝膠上去除。小心地從玻璃板上剝下凝膠，拎著它的下緣將其放入裝有固定液或染色液的盒子里。 |