1. 前言
與其他真核細胞一樣，植物細胞中，糖基化通常發生在分泌蛋白質上，雖然在細胞質蛋白和核蛋白上也發現一些糖基化反應。根據寡糖部分和蛋白質骨架之間的連接方式，可將糖基化分為兩種類型：N -糖基化和 O-糖基化。植物中 N-糖基化研究最多。
1.1 N-糖基化
與其他真核細胞一樣，在植物細胞中，N-糖基化只發生在進入分泌途徑的蛋白質上。它從內質網中的寡聚糖前體 Glc3Man9GlcNAC2 共翻譯轉移到構成初生蛋白質 ( Asn-X-Ser/Thr，X 可以是除脯氨酸和天冬氨酸以外的任意一種氨基酸）N--糖基化序列的特異天冬酰胺殘基上開始，當新合成的蛋白質進入內質網腔后就發生 N 端序列糖基化反應（圖 25-1B )。接著，當糖蛋白從內質網經高爾基體到達其最終目的地時，Glc3Man9GlcNAC2 前體沿著分泌途徑進行進一步加工處理。如果糖基側鏈能被內質網和高爾基體中的糖苷酶和糖基轉移酶加工的話，Glc3Man9GlcNAc2 前體就會被成功轉化為 Man9GlcNAc2 和 Man5GlcNAC2
范圍內的髙甘露糖型 N-聚糖（圖 25-1A)， 以及復雜形式的 N-聚糖。植物復雜形式 N-糖苷有一個掛在中心的近端氨基葡糖上的 α-1-3
巖藻糖；一個與中心少甘露糖連接的 β-1-2 木糖殘基，和/或與它們的末端天線（稱為 Lewisa ) 連接的 Gal/β-3
(Fucα-1-4 ) GlcNAc 寡聚糖末端序列，稱為 Lewisa ( 圖 25-1B ) [1] 。
1. 2 O-糖基化
在植物細胞中 O-糖基化可分為兩種類型。即分泌蛋白糖基化或細胞質/核蛋白糖基化。蛋白質上不同位點的 O-連聚糖的性質不同。
1. 分泌蛋白質的 O-糖基化
對植物分泌蛋白的
O-糖基化的了解還很少。只有少數幾篇文章報道了與植物糖蛋白上的一些絲氨酸或蘇氨酸殘基連接的
O-聚糖。一些糖蛋白，如細胞壁伸展蛋白和液泡中的甘薯貯藏蛋白（sporamin) 都被認為是一類含有一個單半乳糖 O-糖基化的絲氨酸殘基的糖蛋白
[ 2，3] 。分析鑒定水稻被轉運到液泡的谷蛋白也是為了證明哺乳動物黏蛋白型糖基化的存在，植物中這一類型 O-糖基化依然存在爭議 [4] 。第二種類型的分泌蛋白 O-糖基化要求糖蛋白脯氨酸殘基的羥基化，我們已發現植物中的富含羥脯氨酸的糖蛋白（HRGP)。HRGP
是植物中主要表面糖蛋白。這些定位于細胞壁或細胞質膜外表面的 HRGP，有三類蛋白質：伸展蛋白，阿拉伯半乳糖鏈蛋白（AGP ) 和茄科凝集素 (
圖 25-2)。伸展蛋白和茄科凝集素含有由絲氨酸- ( 羥脯氨酸 )4 組成的重復序列，這里 的絲氨酸可被 O-糖基化，而羥脯氨酸可被阿拉伯糖鏈取代
[5] 。這個阿拉伯糖化過程在髙爾基體中發生 [6]。AGP 家族是那些高糖基化的胞外蛋白和細胞質膜蛋白質。其蛋白質部分富含羥脯氨酸（Hyp)
、絲氨酸、丙氨酸、蘇氨酸和甘氨酸，并含有 Ala-Hyp 重復序列。脯氨酰-4-羥化酶的催化作用可將內質網和/或高爾基體中脯氨酸轉換成羥脯氨酸
[ 4，7 ] 。AGP 的 O-糖基化過程是一種添加了被 β-1-6 半乳糖支鏈取代 β-1-3 半乳糖數組的半寡聚糖支鏈的羥脯氨酸后的循序漸進的方式，β-1-6 半乳糖支鏈反過來由阿拉伯糖或者其他的低豐度的單糖依次形成分支（圖 25 -2)。
2. O-GlcNAc 糖基化修飾
另外一種在哺乳動物中得到詳細闡述的
O-糖基化形式是細胞質和細胞核蛋白的 O-GlcNAc 糖基化。這種在蛋白質上添加 O-GlcNAc
的修飾，在真核生物中非常普遍，發生在絲氨酸或蘇氨酸的 β-連接上。盡管序列 Tyr-Ser-Pro-Tb- Ser- Pro -Sef ( 標有
* 是發生糖基化的氨基酸）代表一類典型的 GlcNAc 連接位點 [9] ，但是對可被 OGlcNAc
糖基化的保守序列還不十分清楚。OGlcNAc 糖基化是一種高度動態過程，而且通常與 O-磷酸化修飾交互進行
[10] 。糖基轉移酶的催化作用下，糖基被添加到蛋白質上，而在 OGlcNAc
糖苷酶的催化作用下，糖基被從蛋白質上移除許多細胞活動過程，如蛋白轉運入細胞核、轉錄、細胞骨架附著在細胞膜上或蛋白合成等都參與了這個糖基化修飾，目前對它的確切作用還了解不多。
植物中有關
OGlcNAc 糖基化的報道還很少，與 OGlcNAc 轉移酶相似的兩個被命名為 SPINDLY 和 SEC 的酶已在擬南芥中克隆出來 [
11，13] 。它們在離體條件下具有 OGlcNAc
轉移酶活性，但還不清楚它們在植物體內的天然底物。此外，有報道將一些細胞核蛋白描述為攜帶末端為 GlcNAc 的 O-連聚糖的糖蛋白 [14，15
] 。這些細胞核蛋白是否為 SPIN-DLY 和 SEC 的底物仍是個謎。
1.3 糖基化的異質性
真核細胞的成熟分泌糖蛋白 N-糖基化模式是內質網中的寡聚糖共翻譯轉運過程和其在內質網和高爾基體內加工的共同結果。多肽折疊因子會影響內質網內潛在糖基化位點 [16] 。結果導致蛋白質中的多個 N-糖基化位點中有些位點為無效糖基化位點，其他一些則未能完全糖基化 [17~19] 。
同時，多糖側鏈的修飾加工與其是否接觸到成熟的酶相關。雖然被包被在蛋白分子結構內部的寡糖仍然是未修飾的高甘露糖型
N-糖鏈，但位于蛋白質表面的糖苷將成熟轉變為復雜形式的 N-糖苷 [17] 。這種現象也同樣發生在
O-糖苷上。因此，要鑒定植物糖蛋白的糖基化，不僅需要鑒定糖-蛋白連接及附著在糖蛋白上的寡聚糖的結構，而且還要確定其在蛋白分子骨架上的潛在糖基化位點的分布/定位。
本章的目的是向植物蛋白質組學工作者介紹一些工具和方法，用于確定所鑒定的蛋白是否為糖蛋白，類別以及蛋白骨架上糖苷側鏈的位置。本章的最后部分將論述植物糖蛋白質組學中的糖蛋白鑒定方法。
2. 材料
2.1 這個蛋白是糖蛋白嗎
DIG 糖鏈檢測試劑盒（Roche Applied Science， Mannheim，Germany) ( 保存于 2~8°C )
2.2 我的蛋白是怎樣被糖基化的
1. 應用 Western 印記雜交檢測糖苷
1 ) 凝集素親和檢測方法
( 1 ) TTBS 緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，含 0.5 mol/L NaCl 和 0.1% Tween-20。
(
2 ) Lectin- biotin：GNA ( 雪花蓮凝集素）-生物素（Vector Labs/Abcys，France) ( 保存于
2~8°C ) 和 WGA ( 麥胚凝集素)-生物素（Sigma Aldrich，Lyon，France) ( 保存于 2~8°C ) 。
( 3 ) 鏈霉親和素-過氧化物酶（Amersham Biosciences/GE，Healthcare，Uppsala，Sweden) ( 保存于 2~8℃）。
( 4 ) TBS 緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，含 0.5 mol/L NaCl。
( 5 ) 4-氯-1- 萘酚（Bio- Rad，Hercules，CA ) ( 保存于 -20°C )。
( 6 ) 牛胰核糖核酸酶 B ( Sigma Aldrich) ( 保存于 2~8°C) 。
( 7 ) 甲基比喃甘露糖苷（Sigma Aldrich ) ( 室溫保存）。
( 8 ) 牛晶狀體 α-A-晶體蛋白（Sigma Aldrich) ( 保存于 -70°C ) 。
( 9 ) 卵清白蛋白（Sigma Aldrich) ( 保存于 2~8℃ ) 。
( 10 ) TTBS 緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，含 0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2；1 mmol/L MgCl2 和 0.1% Tween-20。
( 11 ) 刀豆球蛋白 A ( Sigma Aldrich) ( 保存于 5~8°C ) 。
( 12 ) 辣根過氧化物酶（HRP；Sigma Aldrich) ( 保存于 2~8°C ) 。
( 13 ) 大豆凝集素（Sigma Aldrich) ( 保存于 2~8℃）。
2 ) 特異抗體免疫檢測方法
( 1 ) TBS 緩沖液：20 mmol/L Tris -HCl，pH 7.4，含 0. 5 mol/L NaCl。
( 2 ) 明膠（Bio- Rad) 。
( 3 ) 抗 HRP 免疫兔血清 （Sigma Aldrich ) ( 保存于 2~8°C ) 。
( 4 ) 抗蜂毒抗體（蜂毒， Sigma Aldrich ) ( 保存于 2~8°C ) 。
( 5 ) 鼠抗人 Lewisa 單克隆抗體（Calbiochem， Meudon， France) ( 保存于 -20℃）。
( 6 ) TTBS 緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，含 0.5 mol/L NaCl 和 0.1% Tween -20。
( 7 ) 羊抗鼠免疫球蛋白辣根過氧化酶標記抗體（Sigma Aldrich) ( 保存于 -20°C ) 。
( 8 ) 羊抗兔免疫球蛋白辣根過氧化酶標記抗體（Bio- Rad ) ( 保存于 2~8°C ) 。
( 9 ) 來源于蜂毒的磷脂酶 A2 ( agm aAldrich ) ( 保存于 2~8°C) 。
( 10 ) 菜豆凝集素（PHA-L；Sigma Aldrich ) ( 保存于 2~8°C ) 。
( 11 ) 玉米中表達的重組抗生物素蛋白（Sigma Aldrich) ( 保存于 2~8°C ) 。
2. 糖苷的單糖組分分析
( 1 ) 2 mL 帶聚四氟乙婦涂層的螺旋蓋子的瓶子（Interchim， Montlueon， France) 。
( 2 ) 2 mmol/L 肌醇水溶液（保存于 4°C ) 。
( 3 ) 甲醇-HCl 3 mol/L 試劑盒（Supelco，Bellefonte，PA ) ( 保存于 2~8°C )，打開一瓶，用甲醇稀釋到 1 mol/L 甲醇-HCl 的濃度（見注釋 1)。
( 4 ) 無水乙酸 98%，分析純級試劑（Sigma Aldrich，Aldrich) ( 室溫保存）。
( 5 ) 吡啶，99.8% 無水（Sigma Aldrich) ( 室溫保存）。
( 6 ) 硅烷化試劑：六甲基二硅烷+三甲基氯硅烷+吡啶，3 : 1 : 9 ( Sylon HTP ) 試劑盒（Supelco) ( 保存于 2~8°C ; 見注釋 1) 。
( 7 ) 環己燒 Rectapur ( VWR，FontenaysousBois，France) ( 室溫保存）。
( 8 ) 配有 CP-SIL 5 CB 硅膠柱（25 m X 0.25 mm) 的氣相色譜分析設備。
3. 糖苷釋放后的蛋白質分析
1 ) 糖苷釋放的化學處理方法
( 1 ) 配有聚四氟乙烯涂層螺帽的玻璃反應管（Pyrex 組培管）（Bibby Sterilin Stone, Staffs , England)。
( 2 ) 硼氫化鈉溶液：在 100 mmol/L NaOH 溶液中，新鮮配制濃度為 40 mg/ml 的硼氫化鈉溶液。
( 3 ) 98% 無水乙酸，分析純級試劑（Sigma Aldrich，Aldrich) ( 室溫保存）。
2) N - 或 O-糖苷酶酶促方法
( 1 ) 1% 十二烷基磺酸鈉溶液（SDS）
( 2 ) 150 mmol/L 乙酸鈉緩沖液，pH 5.7。
( 3 ) 內切糖苷酶 H : 來源于灰色鏈霉菌的內切糖苷酶 H，經大腸桿菌重組（Roche Applied Science) ( 保存在 2~8°C，冰凍會使酶失活) 。
( 4 ) 0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖液，pH 7.5，含 0.1% SDS。
( 5 ) 0.1 mol/L Tris-HCl 緩沖液，pH 7.5，含 0. 5% Nonidet P40。
( 6 ) Nonidet P40 ( 現稱為 IGEPAL；Sigma Aldrich ) 。
( 7 ) N-糖酰胺酶 F：來源于腦膜膿毒性黃桿菌的 N-糖酰胺酶 F。（Roche Applied Science) ( 保存于 -25~-15℃）。
( 8 ) 10 mmol/L HCl 溶液，pH 2.2。
( 9 ) C18 色譜柱：BondElntC 18 色譜柱（Varian，Palo Alto , CA ) (室溫保存）。
( 10 ) 乙腈，純度 99.5% 以上（Sigma Aldrich ) 。
( 11 ) 100 mmol/L 乙酸鈉緩沖液，pH 5.5。
( 12 ) 來源于豬胃黏膜的胃蛋白酶 A ( Sigma Aldrich ) 。
( 13 ) N-糖酰胺酶 A : 來源于甜杏仁油的 N-糖酰胺酶 A (Roche Applied Science)( 保存于一25~一15°C) 。
( 14 ) 去糖基化酶試劑盒（Prozyme， San Leandro, CA ) ( 保存于 4℃）。
2.3 被糖基化的蛋白在哪里
( 1 ) 50 mmol/L 碳酸氫銨，pH 8.0。
( 2 ) 胰蛋白酶：來源于牛胰腺的經 TPCK 處理的胰蛋白酶 （Sigma Aldrich, Fluka 產品）（ 保存于 -20°C ) 。
( 3 ) 胰凝乳蛋白酶： 來源于牛胰腺的經 TLCK 處理的胰凝乳蛋白酶（Sigma Aldrich) ( 保存于 -20°C ) 。
( 4 ) C18 色譜柱：Merck C18 Spherisorb ODS 2 色譜柱（5 μm，4.6 mm X 250 mm，VWR)。
( 5 ) 溶液 A : 90 : 10 水/乙腈含 0.1% 三氟乙酸（TFA ) 。
( 6 ) 溶液 B : 10 : 90 水/乙腈含 0.1% 三氟乙酸（TFA ) 。
2.4 怎樣對全糖蛋白質組進行分析
1. 含高甘露糖 N - 糖苷糖蛋白的鑒定
( 1 ) TBS 緩沖液：20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.4，含 0.5 mol/L NaCl。
( 2 ) Bradford 蛋白質定量測定試劑：Bio-Rad 蛋白質定量測定試劑（保存于 4°C ) 。
( 3 ) 0.20 μm 針頭過濾器：Filtropur S 0.2 ( Sarstedt， Niimbrecht，Germany) 。
( 4 ) 刀豆蛋白 A-瓊脂糖凝膠：Con A Sepharose 4B ( Amersham Biosciences) ( 保存于 4°C) 。
( 5 ) TBS：20 mmol/L Tris-HCl 緩沖液，pH 7.4，含 0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2 和 1 mmol/L MgCl2。
( 6 ) Poly-Prep 離子交換柱（Bio-Rad) 。
( 7 ) TTBS：20 mmol/L Tris- HCl 緩沖液，pH 7.4 , 含 0.5 mol/L NaCl，1 mmol/L CaCl2，1 mmol/L MgCl2 和0.1% Tween-20。
( 8 ) 甲基-α-D- 吡喃甘露糖苷（Sigma Aldrich) ( 室溫保存）。
2. O-GlcNAc 糖基化糖蛋白的鑒定
( 1 ) 神奇濾布（Calbiochem，Meudon，France) 。
( 2 ) WGA 緩沖液：20 mmol/L Tris - HCl，pH 7.8 , 含 150 mmol/L KCl，2 mmol/L CaCl2，10 mmol/L MgCl2，1 mmol/L 二硫蘇糖（DTT ) 和蛋白酶抑制劑。
( 3 ) 雞尾酒蛋白酶抑制劑（Roche Applied Science) ( 保存于 4°C ) 。
( 4 ) Amicon Bioseparation YM-10 離心超濾管（Millipore， Saint Quentin en Yve lines, France)。
( 5 ) Nonidet P40 ( Sigma Aldrich) 。
( 6 ) N-糖酰胺酶 F : 來源于腦膜膿毒性黃桿菌的 N-糖酰胺酶 F ( Roche Applied Science) ( 保存于一25~一15°C)。
( 7 ) 麥胚凝集素-瓊脂糖（Sigma Aldrich) ( 保存于 2~8°C ) 。
( 8 ) N-乙酰葡糖胺（Sigma Aldrich) 。