植物質膜蛋白的提取和溶解實驗

實驗材料：

擬南芥屬植物

試劑、試劑盒：

超純水                                                                 

EGTA 貯存液                                                                 

NaF 貯存液                                                                  

洗滌緩沖液（WBSC )                                                                  

微粒緩沖液 

儀器、耗材:

華林式攪拌器                                                                  

細胞破碎器 

實驗步驟：

3.1 質膜的分離

1. 分離微粒體部分

從機械破壞的葉、根組織或懸浮細胞中分離 PM 部分首先需要分離含有 PM 的微粒體膜部分。然后經過兩相分離從微粒體部分分離質膜。所有的步驟在 4°C 進行。

1 ) 擬南芥的葉片和根

( 1 ) 迅速收集葉片和根，放在置于冰上的濕潤的紙上，然后用冰冷的蒸餾水簡單漂洗。稱量材料的鮮重。勻漿液與組織的比例是 2：1 [ 介質（ml) /鮮重（g ) ]。全部的勻漿液加入組織，在華林攪拌器中低速勻漿 10s，然后高速離心 4 次每次 10s。

( 2 ) 所得勻漿用一個尼龍布（直徑 100 μm ) 過濾，以去除所有的細胞壁碎片。

( 3 ) 過濾后的勻漿在最高 26000 g 離心 25 min，使葉綠體和線粒體沉淀。

( 4 ) 去除沉淀，用兩張連續的濾紙（直徑分別為 63 μm 和 34 μm) 過濾上清液。

( 5 ) 在最高 84000 g 下離心 25 min，可從上清液中得到微粒體沉淀。所得顆粒沉淀用總體積 9 ml 的微粒緩沖液/20~40 g 鮮重（表 11-2) 重懸。

2 ) 擬南芥懸浮細胞

( 1 ) 通過一個孔隙度 2 的玻璃纖維。懸浮細胞用冷洗滌緩沖液（1：1，WBSC/懸浮細胞）（見 11. 2. 3 節 2 ) 清洗。

( 2 ) 稱量材料的鮮重。

( 3 ) 懸浮細胞在勻漿液中孵育 10 min  {2.5：1，[ 介質（ml) /鮮重（g )]}。

( 4 ) 細胞在華林攪拌器中預先低速勻漿 10s，然后在細胞破碎器中徹底破碎，使細胞在高壓氣體壓力下研碎。通過施加的高壓力（0.54 kbar) 使細胞通過一個直徑 180 μm 的壓力隧道。從高壓向低壓轉移期間細胞獲得高速。通過空穴作用，發射的細胞含爆裂。

( 5 ) 然后細胞勻漿在最高 10000 g 離心 10 min。

( 6 ) 上清液用直徑 100 μm 的尼龍布過濾。

( 7 ) 在最高 50000 g 離心 35 min，從上清液中得到微粒體沉淀。沉淀重新用總體積 9 ml 的微粒緩沖液/20~40 g 鮮重（見表 11-2) 重懸。

2. 兩相分離法分離質膜

( 1 ) 分離質膜與從擬南芥懸浮細胞、葉、根中分離 PM 用的是相同的方案。兩相分離法受溫度變化影響，所以最好始終在低溫房間操作。

( 2 ) 27 g 相系統混合 9 g 懸浮微粒（最多相當于 40 g 鮮重）。過度上樣會影響相分離系統的準確性。

( 3 ) 用力搖晃管子 15~20 次。確保管中物質混合均勻，葡聚糖要與微粒體懸浮液充分混合。

( 4 ) 該系統通過離心 2000 g，10 min 分離成兩個部分。PM 衍生的囊泡優先分布進入 PEG-上層相（upl) ，而來自其他膜的膜囊泡則分布進入下層相（lowl，圖 11-1)。

( 5 ) 為從上層相中純化出 PM，該相被重新進行兩相分離，得到下層相（low2，圖 11-1)。

( 6 ) 通過 9 g 微粒體緩沖液與 27 g 兩相分離體系混合得到上、下新層相。

( 7 ) 在勻漿以 2000 g 離心 10 min 之后，得到兩個新的層相 up2 和 low2。分別將 upl 和 low2 混合，lowl 和 up2 混合。

( 8 ) 經過其他的勻漿和離心步驟，得到了分出的相 up3、low3、up4、low4 ( 圖 11-1 )。

( 9 ) 上層相 up3 被收集。

( 10 ) 上層相 up4 與下層相 low3 混合在一起。

( 11 ) 經過勻漿/離心，洗滌后的 up4 被收集。

( 12 ) 在 60 ml 洗滌緩沖液中稀釋上層相 up3 和 up4，（表 11-4)，然后在最高 85000 g 進行沉淀離心 35 min。針對葉片和根系懸浮細胞時，在最高 176000 g 粒化 30 min 的情況下。

( 13 ) 沉淀的 PM 蛋白質在加入了 10 μmol/L 的亮抑蛋白酶肽和 5 mmol/L DTT 的洗滌緩沖液中重懸，在液氮中速凍，可長期放于 -80°C。

( 14 ) 每 100 g 鮮重蛋白質產量為 1.5~2.5 mg ( 見注釋 3 ) 。

即使仔細地運用兩相體系，徹底純化也幾乎是不可能的；因此，有必要通過其他膜和可溶性蛋白估計 PM 部分的相對污染（見注釋 4 和注釋 5) 。



3.2 富集疏水性蛋白質

在堿處理中，對 PM 膜的尿素-氫氧化鈉處理使得疏水性蛋白水通道蛋白得到更好的復性（見注釋 6 和 圖 11-2)。



( 1 ) PM 蛋白（0.5 mg) 在 15 ml 的緩沖液 A 中（見表 11- 5 ) 于冰上 5 min，然后在最高 100000 g 條件下離心 10 min。

( 2 ) 棄去上清液，得到的沉淀在 20 mmol/L  NaOH 中重懸并且在最高 100000 g 離心 10 min。

( 3 ) 沉淀的蛋白質用緩沖液 B ( 表 11 - 6 ) 洗凈，然后在最高 100000 g 下離心 10 min。

( 4 ) 最后得到的沉淀在 PM 保存緩沖液（表 11 - 4 ) 中重懸進行蛋白質實驗。（見注釋 3)。

( 5 ) PM 蛋白部分由樣本緩沖液 SB2X（表 11- 7 ) 稀釋兩倍后進行 SDS-PAGE 電泳（圖 11-3 和見注釋 7) 。



3.3 雙向凝膠電泳分離蛋白質

1. 蛋白質的溶解

( 1 ) PM 蛋白（120 μg；全部的 PM 或經尿素氫氧化鈉處理的 PM ) 在最高 100000 g 富集 15 min。

( 2 ) 富集沉淀在 350 μl 的雙向電泳溶液（表 11- 8 ) 中重懸，不斷搖動 1 h。

( 3 ) 在 10000 g 離心 10 min 后，小心收集上清液，用雙向電泳溶液調整至 350 μl (表 11-8)。




2. 2D 凝膠電泳

( 1 ) 用商業化的固定 pH 梯度膠條（線性或非線性 pH 梯度 3~10，18 cm 長；Amersham  Pharmacia  Biotech) 進行等電聚焦（IEF) 實驗，使用 IPGphor 設備（Amersham   Pharmacia  Biotech)。

( 2 ) 膠條在 350 μl 的樣品蛋白質上樣后重新水化，被動水化 4 h，然后在恒定電壓 ( 50V ) 條件下主動水化 7h。

( 3 ) 膠條在如下條件下聚焦：從 0~300V，1 min；300V 3 h；300~3500V，1h，3500V，80 kVh。

( 4 ) IEF 之后，膠條繼續在含有 2% DTT 和 2.5% 巰基乙醇的平衡液里室溫下平衡 ( 根據 Chevallet 等，注釋 26) 。

( 5 ) 二向電泳（SDS-PAGE ) 在均勻的 11% T 凝膠（Protean I I，Bio-Rad ) 中進行。

( 6 ) 膠條用低熔點的瓊脂糖 [28] 密封在電泳凝膠的上方。

( 7 ) 電泳：20 mA，1 h，然后在 40 mA，4~5 h。

( 8 ) 為了方便其后的質譜分析，凝膠分別用銀染或考馬斯 G-250 進行染色（圖 11-4 和 圖 11-5，見注釋 8) 。