1、除去保護
Fmoc保護的柱子和單體必須用一種堿性溶劑（piperidine）去除氨基的保護基團。
2、激活和交聯
下一個氨基酸的羧基被一種激活劑所激活。化學工藝常用HBTU/HCTU/HITU/HATU+NMM/DIPEA或HOBT+DIC作激活劑，激活的單體與游離的氨基反應交聯，形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅使反應完成。循環：這兩步反應反復循環直到合成完成。 氨基酸縮合結束后，可用適量TFA進行洗脫，根據起酸堿性，可選擇10%TFA/DCM溶液，至100%TFA，以此類推。
3、HPLC分析純化
分析HPLC使用柱子和泵系統，可以經受傳遞高壓，這樣可以用極細的微粒（3-10μm）做填料。由此多肽要在幾分鐘內高度被分析。HPLC分兩類：離子交換和反相。 離子交換HPLC依靠多肽和固相間的直接電荷相互作用。柱子在一定PH范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸組成表現出相反電荷。分離是一種電荷相互作用，通過可變PH，離子強度，或兩者洗脫出多肽，通常，先用低離子強度的溶液，以后逐漸加強或一步一步加強，直到多肽火柱中洗脫出。離子交換分離的一個例子使用強陽離子交換柱。如sulfoethylaspartimide通過酸性pH中帶正電來分離。
反相HPLC條件與正常層析正相反，多肽通過疏水作用連到柱上，用降低離子強度洗脫， 如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價吸附到硅上的碳氫烷鏈構成，這種鏈長度為G4-G8碳原子。 由于洗脫是一種疏水作用。長鏈柱比短鏈對小的， 高帶電肽好。另一方面大的疏水肽用短鏈柱洗脫好。 然而，總體實踐中， 這兩類柱互變無多少顯著差別，別類載體由碳水化合物構成， 比如苯基。
典型的操作常由兩綬沖劑組成，0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile 0.1%TFA--H2o稀acetonitrile。用線型梯變以每分鐘0.5%到1.0%改變的速度混合。常見分析和純化用柱為4.6×250mm（3-10μm）和22×250mm（10μm）。如果用徑向填柱，那么大小是8×100（3-10μm）和25×250mm（10μm）。
大量各種緩沖劑含許多不同試劑，比如磷酸、NH4HCO3、 醋酸鈉、TFA/TEA，磷酸鈉、異戊酚等。這樣許多不同組合可形成緩沖劑，但要注意：硅反相柱料不能長時間暴露于高pH，甚至微堿pH， 因為這樣會破壞柱子。
不要把肽含量和純度搞混了，肽的純度可能是100%， 而肽含量相關帶電基團（如Arg, Lys ）的抗離子量和肽親水性決定，這是合成肽的本身特性。