1、保留型酶的“兩步法”機制
大多數葡萄糖苷酶都是保留型葡萄糖苷酶，其催化機理通常都遵循“兩步法”機制。
第一步：作為親核基團的羧基負離子親核進攻糖苷鍵上的異頭碳，同時作為廣義酸堿對的另一個催化羧基上的氫與糖苷鍵上的氧原子形成氫鍵，第一次形成含氧碳正離子樣過渡態（Oxocarbenium-like transition state）。經過鍵的形成有斷裂，糖基分子的異頭碳構型發生第一次翻轉，并與親核羧基形成酯鍵，生成糖基-酶共價中間體，同時釋放出一分子糖配基。
第二步：糖基受體分子的活性羥基氫與發生解離的廣義酸堿對羧基離子相互作用，同時受體分子的活性羥基氧親核進攻糖基-酶共價中間體中糖基分子的異頭碳，再次形成含氧碳正離子樣過渡態，最終使得異頭碳構型發生第二次翻轉，并與受體羥基氧形成共價鍵，完成反應。
2、翻轉型酶的差異
在翻轉型葡萄糖苷酶中，由于催化殘基與底物之間的距離跟保留型酶的有所不同，導致受體分子從相反的方向進攻異頭碳，不發生異頭碳的構型的二次翻轉，從而生成不同構型的產物。
3、受體分子決定反應類型
由于葡萄糖苷酶的催化機理，大多數葡萄糖苷酶都具有轉糖苷活力。當受體分子為活性水分子時，酶表現出水解酶活力；當受體分子為帶有羥基的非水分子時，酶表現出轉糖苷活力。