試劑、試劑盒 PCR 緩沖液ddH20基因組 DNAdNTP寡核苷酸引物
儀器、耗材 離心機和轉子丙烯酸防護板過濾阻擋吸頭多道移液器PCR 儀托盤 固定器裝置底座管蓋小管
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
含 15 mmol/LMgCl2 的 10XPCR 緩沖液 (GeneAmpPCR 緩沖液 I，AppliedBiosystems)
滅過菌的 ddH20
2. 酶和酶緩沖液
TaqDNA 聚合酶，(AppliedBiosystems 或 Invitrogen)
3. 核酸和寡核苷酸
基因組 DNA
10 mmol/L dNTP(GeneAmpPCRdNTP 混合物，AppliedBiosystems)
寡核苷酸引物（Invitrogen 公司合成，稀釋成 lOumol/L)
4. 離心機和轉子
用翻轉吊桶式轉子和微板適配器離心
5. 專用設備
丙烯酸防護板（acrylicshield)
過濾阻擋吸頭（filterbarriertips)
多道移液器（Eppendorf 或 ApogentDiscoveries)
PCR 儀，96 孔（AppliedBiosystemsGeneAmp9700)
托盤/固定器裝置和底座，96 孔（AppliedBiosystems)
管蓋，一條 8 個（USAScientific 或 AppliedBiosystems)
小管，0.2 ml，一條 8 個（USAScientific 或 AppliedBiosystems)
二、方法
1. 在冰上融化 dNTP、10XPCR 緩沖液和未標記的引物。Taq 酶在加入反應混合物之前應保存在-20°C。在丙烯酸防護板后融化標記的引物。
2. 每一個反應的混合物包括：
滅菌 ddH20 6.95ul
含 MgCl2 的 10XPCR 緩沖液 1.25ul
10mmol/LdNTP 0.25ul
10mmol/L 未標記引物 0.5ul
標記引物 0.5ul
在優化實驗條件過程中，如果 PCR 產物的放射信號強度太低，可以增加標記引物的用量，同時按相應
比例調整 ddH20 的體積。
TaqDNA 聚合酶（終濃度為 0.25U) 0.05ul
對于一個 96 孔微孔板，準備用于 100 個反應的混合物。
3. 混勻，按等份加入放置在冰上的 PCR 板中（9.5ul/樣品）。
4. 用多道移液器加入 3ulDNA(60ng)，混勻。
5. 把蓋子蓋緊，將板放入預熱到 94°C 的 PCR 儀中。
6. 如果產物大小是 200bp, 擴增 30 個循環。循環參數如下：94°C 初始變性 5 min;30個循環的 94°C 變性 30s; 根據經驗確定的退火溫度（Tm) 退火 30s;72°C 延伸 30s。最后一步 72°C 延伸 7 min。值可以通過引物序列計算出來，公式為 2(A+T)+4(G+C)。
7. 擴增完成后，將樣品于-20°C 凍存，或者直接進入方案 3。