應用現代HPLC-MS/MS分析技術，能夠靈敏、抗干擾且高度自動化地檢測出水體中具有典型意義的活性物質的內分泌干擾物，如合成和天然的類固醇激素。
激素在自然界中的重要性不言而喻，它會對某一物種的整個機體產生影響。從生長的調控乃至機體組織的再生功能皆受到類固醇激素的影響和作用。合成的類固醇激素能對人類和動物的生長發育或繁衍后代發生影響。研究證明，水體中一些高濃度激素性活性物質會導致某些雄性魚類發生雌性化變異現象。
歐洲2000/60/EG規范及其補充和修正，對水體保護實施了嚴格的質量管控。在其優先級、關注級和嚴重危險級的物質中，列入了天然以及合成類固醇激素，如17-α-炔雌醇、17-β-雌醇等，并針對其監測提出了低水平限的年平均環境質量規范要求。對于內陸水域而言，該水平限為0.035ng/L（17-α-炔雌醇）及0.4ng/L（17-β-雌醇）。注意檢測限只允許為各UQN規定值的30%，執行該措施的前提是存在一種合適的儀器或技術，能夠快速可靠地對低濃度的激素物質定性和定量。在分析中采用和建立的分析方法往往達不到所要求的靈敏度，因此迫切需要開發一種新方法。
圖1. 在線固相萃取運行方式圖解（a；進樣；b：萃取；c：淋洗；d：在線富集）。
選擇合適的技術
為測定具激素作用的物質，在分析中應用了氣相色譜法(GC)和高效液相色譜法(HPLC)。以GC法測定激素時，多數情況下需要采取附加的衍生化步驟，以便使分析溶質的極性適合于所用的氣相色譜柱。但繁雜的步驟往往對方法的重現性和可靠性產生不良影響。對GC而言，低至亞毫克的檢測限通常只能借助于大體積的進樣（如1000ml）實現，要求對目標組分強力濃縮。為將濃縮系數從1:1000提高到1:5000，一般要采用液-液萃取（LLE)或在線固相萃取（SPE），但這些方法非常耗時且成本高。
本文在HPLC基礎之上開發出一種穩定、快速的高自動化的方法。在HPLC-MS/MS聯用技術方面采用直接進樣積累的經驗，為進一步開發適用于飲水、地下水和地表水中激素類物質的測定提供了基礎。為了達到盡可能低的檢測限，研究人員還開發了在線富集方法。
直接進樣法
選擇6種激素以HPLC-MS/MS聯用方法進行加工，其色譜和光譜法的運行條件于沃特世Acquity UPLC xevo TQ-S超高效液相色譜儀上進行優化，進樣量根據所加體積予以優化。實驗表明，大體積進樣直至250μl并無問題，而進一步提高至1000μl并不能提供更多優點。由于放棄了對分析溶質預富集濃縮步驟，因此可直接進樣無需樣品前處理。對含有懸浮物質的樣品則事先將水樣通過玻璃棉濾器加以過濾。可采用注射器前置濾頭直接于制備自動進樣器之前做好。在有效實驗范圍2~100ng/L濃度內，獲得了良好的線性和方法重現性的結果。采用加入具有不同基體的水的標準加入法試驗，表明方法能夠適應于地表水的研究。對于所有檢測的物質而言，檢測限始終介于5~10ng/L。
在線富集法
為了改進檢測限，研究人員基于直接進樣法的結果開發了一種在線富集技術。應用沃特世兩種相互獨立的泵系統以及多組6通轉換閥（見圖1d)，借助于附加的泵系統進行在線富集，而二元泵則進行淋洗和色譜分離。方法步驟均實現全自動，從而獲得了較高的重現性。為進行在線固相萃取，需要附加的轉換閥，以便對固相萃取富集柱予以條件化，將分析溶質從樣品中予以富集并將其以反向液流的方式沖洗到色譜分離柱上。在方法確證的范圍內對重要影響因素進行了優化。例如適當的固相萃取柱的選擇關乎到樣品的富集和色譜分離柱。此外，還優化了進樣體積以及進行裝載和淋洗的流速。
圖2. 在線固相萃取富集法的色譜圖（TIC）（c=100ng/L，富集體積5ml）。
閥路轉換系統
將必要的閥路轉換系統顯示于示意圖中（見圖1a、1d)，并作以下描述：
進樣：將5ml樣品環以事先過濾的水樣充滿，借助于附加泵系統（QSM)對固相萃取富集柱進行條件化；
萃取：啟動閥1（V1)借助于附加泵QSM將樣品通過固相萃取富集柱進行富集，流速為2ml/min，組分的萃取于2.5min結束；
淋洗：此時啟動閥2（V2)， 用二元泵以反流模式從固相富集柱上將所萃取富集的物質沖洗到色譜柱上，借助淋洗液流將物質送到色譜柱上進行分離并以質譜檢測器檢測，用色譜法所用的洗脫混合液進行淋洗。
圖2為所研究的6種激素總離子色譜圖。結果表明，對于6種激素均能夠進行靈敏、重現性較好的分析。相對于負載較少的水體所研究的地表水基體對富集柱的使用壽命并無明顯不利影響。
小結
直接進樣法或在線固相萃取法，均適用于合成和天然激素的HPLA-MS/MS測定。方法的有效性確證均系通過標準加入法加入飲水、地下水和地表水的方式進行，并確立了方法的穩定性。
在線固相萃取富集法
在線固相萃取法能夠使樣品萃取與HPLC-MS/MS聯合，以提供重現性和靈敏度良好的結果。完全的自動化提高了樣品測定的流通量并提高了工作效率。由于條件化和淋洗等所有工作步驟均為自動運行，提升了分析的效率，并減少了溶劑的消耗，摒棄一次性材料從而降低了運行成本。方法僅需要數毫升樣品，因此能進一步節約和簡化取樣、運輸、樣品貯存以及樣品冷藏等步驟。