1、樣品制備
①前增菌 在非選擇性培養基中對試樣進行前增菌使沙門氏菌開始生長。前增菌方法因產品類型而不同,但必須按 AOAC967.26A 或《細菌分析手冊》現行版執行。
②選擇性增菌 按常規培養方法分別移取培養后的前增菌的培養物1mL 轉種于裝有10mL 亞硒酸鹽胱氨酸肉湯管中(預熱至35℃)和裝有10mL 四硫磺酸鹽肉湯管中(預熱至35℃)于35℃培養6h 但下列食品除外。
生食品和含有高濃度雜菌的食品:將亞硒酸鹽胱氨酸和四硫磺酸鹽肉湯用于35℃培養18h±2h。
③后增菌 從培養箱中取出選擇性增菌培養物,用手或渦旋混合器混合。移取1mL四硫磺酸鹽培養物轉種到裝有10mLGN 肉湯管中(預熱至35℃)移取1mL 亞硒酸鹽胱氨酸培養液轉種到另一支裝有10mLGN 肉湯管中(預熱至35℃)GN 肉湯于35℃培養12～18h。生食品和含有高濃度雜菌的食品除外。將四硫磺酸鹽和亞硒酸鹽胱氨酸管放回35℃培養箱,培養至總計24h±2h。
生食品和含有高濃度雜菌的食品:于35℃培養 GN 肉湯6h。將四硫磺酸鹽和亞硒酸鹽胱氨酸管放回35℃培養箱,培養至總計24h±2h。
2、DNA雜交分析
①將水浴鍋充水至4cm,溫度調到65℃±1℃。
②準備細胞溶解液 加6mL 溶解劑緩沖液到濃縮細胞溶解劑瓶中,輕搖至完全溶解置于冰上。(注意:溶解后的細胞溶解液貯存于-20℃下可保持60天。在室溫化凍,化凍后應置于冰上。使用后馬上將未用完的溶液回到-20℃。)
③每檢測25份樣品準備1L 1倍洗液50mL20倍洗液加950mL蒸餾水或去離子水。
④每檢測25份樣品準備一個含有300mL1倍洗液的金屬洗滌槽,蓋上蓋置65℃水浴備用。
⑤每檢測25份樣品另準備兩個含有新鮮的300mL 1倍洗液的洗槽,蓋上蓋置室溫備用。
⑥標記足夠數量的12mm×75mm 玻璃試管每次檢測包括1個陽性對照管和1個陰性對照管。將試管放在每排5孔的試管架上。
⑦將適當數量的測桿放入測桿支架上。置于1倍沖洗液(室溫)中備用。
⑧從35℃培養箱中取出樣品 GN 肉湯。渦旋混合或以其他方式混合每一培養物。每一樣品從2管 GN 肉湯(一管源于四硫磺酸鹽,一管源于亞硒酸鹽胱氨酸)中分別移取0.25mL 放入單個試管中。在數據表上記錄樣品的編號。
⑨混勻陽性和陰性對照液。移取0.5mL 陽性對照液放人陽性對照管中,移取0.5mL 陰性對照液放入陰性對照管中。將對照液放回2～8℃貯存。
⑩加0.10mL 細胞溶解液于每一試管中,用手振搖試管架5s,于室溫下培養試管5min。(注意:加入溶解液后,應致使溶液呈現藍色,若任何管均不呈現藍色,重新檢查是否加入了溶解液。)
?將試管架放入65℃水浴中,加0.20mL 探針溶液于每一試管中,用手振搖試管架5s 將探針溶液放回2～8℃貯存。(注意:加人探針溶液后,溶液將有明顯的顏色改變,若沒有出現顏色變化,重新檢查是否加入探針溶液。)
?用吸水紙吸干測桿外的水漬(用手拿測桿柄的頂部)。將測桿放入試管內,上下5次混勻試管內容物。將含有測桿的試管置65℃培養1h。
?準備第二個放置12mm×75mm試管的試管架,作好標記。
?足量的1倍酶接合劑的制備,按1:100混合濃縮的酶接合劑和1倍沖洗液。分裝0.75mL1倍酶接合劑于每一空管中。將剩余的100倍濃縮的酶接合劑放回到2～8℃貯存。
?將測桿從試管內取出,在65℃洗液中輕輕涮洗1min。
?用吸水紙吸去斑漬,把測桿放在含有酶結合劑的第二個試管內,室溫培養20min。
?準備第三個試管架并作好標記,包括附加的空白管。
?分裝0.75mL酶底物-色原到每一空管。將剩余的酶底物-色原溶液放回2～8℃貯存。(注意:分裝好的酶底物-色原溶液在使用前應達到室溫,至少放置5min)。
?從酶接合劑管中取出測桿,于室溫下新配制的沖洗液中輕輕涮洗測桿1min。
?在吸水紙上將測桿吸干。將測桿放入裝有酶底物色原管的第三個試管架上,在室溫下培養20min。
?從試管中取出測桿并棄去。加0.25mL 終止液于裝有酶底物色原的每一試管中,包括空白用手振搖試管架使內容物混合。
?在450m 處測量吸收值 A。將參比管放在光度計左邊的參比室中,將試樣管放在光度計右邊的樣品室中,讀出每管的吸收值。吸收值將會以數字顯示出來。待讀數器穩定后方可在數據表上記錄每一管的結果。
a.將標有“空白”的試管放入光度計左邊的參比室中,陰性對照管放入光度計右邊的樣品室中,測定陰性對照的吸收值。
b.將標有“空白”的試管放入光度計左邊的參比室中,陽性對照管放入光度計右邊的樣品室中,測定陽性對照的吸收值。
c.將陰性對照管放入光度計左邊的參比室中,待測樣品管放入光度計右邊的樣品室中測定待測樣品的吸收值。
3、數據分析
①陰性對照 A 應為≤0.15(以空白作對照讀取)。
②陽性對照 A 應為≥1.00(以空白作對照讀取)。若未得到這些結果,應重新進行檢測。
陰性標準如果 A≤0.10(以陰性對照作對照讀取),則待測試樣可判定為陰性(無沙門氏菌存在的反應)。
陽性標準如果 A>0.10(以陰性對照作對照讀取),則待測樣品可判定為陽性(有沙門氏菌存在的反應)。
4、DNA雜交陽性結果的確證
經 DNA 雜交分析檢出的陽性樣品必須用標準的培養法加以確證。除極少的情況外,僅以GN 肉湯培養物用于確證,而四硫磺酸鹽肉湯和亞硒酸鹽胱氨酸肉湯培養物應被保留(2～8℃),用于 GN 肉湯不能確證的情況。按常規標準培養方法將培養物劃線于 HE,XLD 和BS 平板,將典型和可疑菌落按經典方法進行生化和血清學鑒定。