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  • 發布時間:2021-11-12 21:52 原文鏈接: 沙門氏菌熒光酶免疫分析篩選方法實驗過程酶免疫檢測

      ①FS法

      a.接通熒光計和打印機電源,至少預熱1h。

      b.從鋁箔袋中取出所需數量的微孔測試板每個食品樣品一個孔,另加4個孔做對照用。將板穩固地卡入托架中。各移取100μL 陰性對照抗原于A-1,A-2和A-3的每個孔中。移取100μL 陽性對照抗原于A-4中。移取每100μL 加熱的M肉湯樣品于單獨的孔中。在所提供的記錄紙上記錄樣品的位置。

      c.將托架置于20~25℃培養60min。

      d.培養后,從孔中吸出樣品,用洗板器/移液器加300uL PBS-吐溫溶液于每個孔中(a)重復此步驟4次以上。(b)吸出最后一次沖洗液。反轉托架,在吸水紙上用力拍打托架幾次以除去最后的殘液。

      e.加100uL酶接合劑于每個孔穴的底部,于20~25℃培養40min。

      f.在培養期間,制備酶底物,加1片4-MUP 酶底物于5.2mL底物稀釋劑甲。解1片酶底物可供兩個微量板使用,不時地旋搖至酶底物溶解。

      g.重復步驟d(a)和d(b)。

      h.加200L4-MUP酶底物于每個孔杯的底部,于20~25℃培養20min。

      i.加50μL終止液于每個孔杯內。

      ②ME,VI和VR法

      a.接通讀數器和打印機電源,至少預熱15min。

      b.按①b進行。

      c.將托架于35℃培養25min。

      d.將加水復原的酶接合劑于35℃預熱。

      e.在培養期間,制備酶底物,加一片 PMP 酶底物于5.2mL 酶底物稀釋液中溶解一片酶底物可供2個微量測試條使用。將酶底物于35℃預熱,不時地旋搖溶液至酶底物片溶解。

      f.按步驟①d進行。

      g.加100μL 復水的酶接合劑于每個孔的底部,于35℃培養20min。

      h.重復步驟①d(a)和d(b)。

      i.加200uL PMP酶底物于每個孔的底部,于35℃培養15min。

      j.加50μL 終止液于每個孔中。

      三、讀數

      ①FS檢測 將托架放在讀數器上,讀取每個對照和樣品孔的相對熒光單位(RFU)計算3個陰性對照孔的RFU平均值。單個陰性對照值應是≥RFU 平均值和≤1.15RFU 平均值。如果有一個值在此范圍外,棄去那個值并重新計算;如果有2個值在此范圍外,實驗則無效,必須重做。用2.3乘有效的陰性對照的平均值即得出臨界值(cut off value)任何樣品的值等于或大于臨界值時,即為有效反應。

      如果陰性對照值的平均值超過1600RFU,臨界值就會超出讀數范圍,實驗則無效。沖洗不徹底以及酶底物變質都會使陰性對照出現較高的值。

      ②ME檢測 將托架放于讀數器上,讀取在550nm 處對照和樣品孔的吸收值。計算3個陰性對照孔的吸收值的平均值(X)。單個陰性對照值應是≥0.85X和≤1.15X。如果有1個值在此范圍外,棄去那個值并重新

      算平均值;如果有2個值在此范圍外,實驗則無效必須重做。用1.6乘有效的陰性對照值的平均值,即得到臨界值。任何一個樣品的值等于或大于臨界值即判斷為陰性。

      ③檢測將孔中的顏色與比色卡的顏色進行比較。將與兩個陰性范圍的顏色相同的任一孔判斷為無反應;具有與陽性范圍類似顏色的任一孔判斷為有反應。

      ④VR法從每一檢測孔中移取200L,至清潔的微量板的孔中。除用1.65乘有效的陰性對照值的平均值得到臨界值外,均按②ME 檢測進行。

      EA陽性樣品的確證EIA檢視的陽性表明可能存有沙門氏菌。然而,由于抗體可能與一些其他細菌發生交叉反應,故應進行確證試驗。按常規培養方法從四硫磺酸鹽肉湯和M肉湯管接種劃線于 HE,XLD和BS平板,對培養后平板上的典型或可疑菌落按AOAC967.26C,967.27,967.28進行鑒定。


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