活體動物體內光學成像（七）

關于生物發光與熒光及其它技術的比較
34. 熒光檢測與生物發光檢測的優勢與劣勢比較如何？  熒光發光需要激發光，但生物體內很多物質在受到激發光激發后，也會發出熒光，產生的非特異性熒光會影響到檢測靈敏度。特別是當發光細胞深藏于組織內部，則需要較高能量的激發光源，也就會產生很強的背景噪音。作為體內報告源，生物發光較之熒光的優點之一為不需要激發光的激發,  它是以酶和底物的特異作用而發光,  且動物體自身不會發光，這樣生物發光就具有極低的背景。雖然熒光信號遠遠強于生物發光，但極低的自發光水平使得生物發光的信噪比遠高于熒光。另外，生物發光信號可以用于精確定量。因為熒光酶基因是插入細胞染色體中穩定表達的，單位細胞的發光數量很穩定。   即便標記細胞在動物體內有復雜的定位，亦可從動物體表的信號水平直接得出發光細胞的相對數量。而對于熒光，光在體內路徑較長。信號水平取決于激發光的強度、發光細胞的數量、靶點的深度，光線穿過的組織對其的吸收及散射等因素，使得熒光強度很難定量。  因為這些原因，目前大部分高水平的文章還是應用生物發光的方法來研究活體動物體內成像。  但是，熒光成像有其方便，便宜，直觀，標記靶點多樣和易于被大多數研究人員接受的優點，在一些植物分子生物學研究和簡單的動物體內研究方面也得到應用。對于不同的研究，可根據兩者的特點（表1）以及實驗要求，選擇合適的方法。  
　表1 生物發光及熒光特點的比較

35. 為什么用熒光素酶, 而不是用綠色熒光蛋白來檢測體內發光?  一方面是熒光素酶的偏紅光比綠色熒光蛋白的綠光在體內的穿透性要強近一百倍。另一方面, 熒光  素酶是靠酶和底物的相互反應發光，特異性很強。這樣一來，得到的信噪比很高。而熒光蛋白需要激發光來產生反射光。老鼠的毛皮、肌膚以及一些食物都會產生非特異性熒光，造成很強的非特異性背景光，得到的信噪比很小。雖然熒光蛋白的發光強度很高，大量應用于體外檢測；但熒光酶標記的方法更適合于體內檢測。熒光酶體內檢測的靈敏度要比熒光蛋白在體內的靈敏度至少高三個數量級(1000倍)。
36.  發光的波長與體內的穿透性如何關系？  熒光素酶發出的光主要是偏紅光，與綠色熒光蛋白(GFP)的綠色熒光不同。熒光素酶的偏紅光比綠色熒光蛋白的綠光在體內的穿透性要強近一百倍。因為光在哺乳動物組織內傳播時會被散射和吸收，不同類型的細胞和組織吸收光子的特性并不一樣。血紅蛋白（hemoglobin）是造成體內可見光被吸收的主要因素，其吸收可見光中藍綠光波段的大部分。但是在可見光大于600納米的紅光波段，血紅蛋白的吸收作用卻很小。因此，在偏紅光區域,  大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到。
37. 相對于傳統技術，生物發光成像技術的優勢在哪些研究領域？  該技術是一項在某些領域有很大不可替代優勢的技術，但是并不是萬能的技術。與傳統技術相比，腫瘤轉移研究，基因治療，流行病學的發病學研究，干細胞示蹤，白血病的相關研究等是該技術非常有優勢的領域。在藥物開發方面，用該技術進行腫瘤的藥效研究，比傳統方法更靈敏，還可以通過一系列轉基因疾病動物模型，來快速直觀的進行相關疾病的發病機理和藥物篩選研究。
38. 生物發光成像不能標記的領域？ 小分子藥物，多肽等。這些方法現今為止的最好的標記方法還是以放射性標記。
39.  生物發光成像和小動物CT比較有什么特點和優勢？  小動物CT的基本原理是利用X射線成像，通過對所觀察對象的密度變化，進行動物內部結構方面的研究。他的優點是分辨率高，不需標記。缺點是特異性差，  在腫瘤很小時無法區分腫瘤細胞和正常細胞，并且對于腫瘤細胞的活躍程度不敏感。如2005年1月JCI的一篇關于乳腺癌骨轉移的文章里，詳細比較了小動物CT與生物發光成像在腫瘤轉移方面的靈敏度。小動物CT要在接種16天以后，成瘤很明顯后才能夠觀察到骨轉移的存在。而生物發光成像在接種后當天就可以實時觀察到癌細胞的轉移和走向。并且，小動物CT需要對動物有較強的X-射線照射，  容易引起突變，對動物的生理有一定影響。
40. 小分子藥物的標記用熒光與PET，哪一個更好？ 如果用熒光蛋白，可以標記細胞或病毒。  如果使用合適的熒光小分子， 如Cyt5.5等，可以標記蛋白例如抗體等大分子或者多肽。但是再小的分子如小分子藥物等，只能用放射性同位素標記，  用PET或SPECT的方法進行研究。 因為即使熒光基團如Cyt5.5也會影響小分子藥物的藥理藥效和代謝活動。
41. 體內可見光技術和其它體內成像技術(PET, CT, 及MRI)的比較 簡單優點：適用于小動物的研究，靈敏度高，特異性好，操作簡單，無放射性，價錢便宜。缺點：無法標記小分子藥物，暫不適用于人類和臨床(正在研究中)，分辨率低，體內精確定位有限。