活體動物體內生物發光和熒光成像技術基礎原理與應用三

4．干細胞及免疫學

用熒光素酶標記干細胞有以下幾種方法：一種是標記組成性表達的基因，做成轉基因動物，干細胞就被標記了，若干細胞移植到另外動物體內，可以用活體生物發光成像技術示蹤干細胞在體內的增殖、分化及遷徙的過程；另外一種方法是用慢病毒直接標記干細胞后，移植到體內觀測其增殖、分化及遷徙過程，研究其修復、治療損傷或缺陷部分的效果，進一步探討其機制。

可以通過標記免疫細胞，觀察免疫細胞對腫瘤細胞等的識別和殺死功能，評價免疫細胞的免疫特異性、增殖、遷移及功能等；通過標記異體細胞，觀察異體細胞對器官移植影響；也可進行一些關于免疫因子的研究等。

5．基因表達模式與基因功能研究

研究基因表達可以從影響基因表達的各個不同的層面進行相關的研究，如利用融合蛋白（p27-luc融合蛋白研究其在Cdk細胞分裂周期的表達），興趣基因啟動子控制的熒光素酶（Catenin在腫瘤轉移的信號傳導機制），siRNA方式和轉基因動物等方法。

為研究目的基因是在何時、何種刺激下表達，將熒光素酶基因插入目的基因啟動子的下游，并穩定整合于實驗動物染色體中，形成轉基因動物模型。通過這種方法實現熒光素酶和目的基因的平行表達，從而可以直接觀察目的基因的表達模式，包括數量、時間、部位及影響其表達和功能的因素等；也可用于研究動物發育過程中特定基因的時空表達情況，觀察藥物誘導特定基因表達；以及其它生物學事件引起的相應基因表達或關閉。

6．蛋白質相互作用

可利用動物體內生物發光成像技術研究活體動物體內蛋白與蛋白的相互作用。其原理是將分開時都不單獨發光的熒光酶的C端和N端分別連接在兩個不同的蛋白質上，若是這兩個蛋白質之間有相互作用，熒光酶的C端和N端就會被連接到一起，激活熒光素酶的轉錄表達，在有底物存在時出現生物發光。在活體條件下研究藥物對蛋白質相互作用的影響，可以觀察到在體外實驗中無法模擬的活體環境對蛋白質相互作用的影響。

7．細胞凋亡

利用活體動物生物發光成像技術，直接觀察活體動物體內的細胞凋亡。具體原理是用分子生物學方法在熒光酶的兩端連接上抑制其發光的蛋白(如雌激素)，但在其連接處加上caspase (細胞凋亡時特異表達的一種酶)的酶切點。細胞發生凋亡時，表達caspase，切開抑制熒光酶發光的蛋白，使熒光素酶開始發光。

8. 疾病機理

可以標記與某種疾病密切相關的基因，做成轉基因小鼠，通過特定的藥物作用或其他條件下該基因表達的變化，來推測該疾病的發病機理和藥物對疾病治療的效果等。

9．其他

如RNAi、蛋白質核運輸等。在熒光素酶基因的一端接要研究的蛋白質的基因，另一端接肯定在細胞核內表達的蛋白的基因，當核外的蛋白運輸到核內時，就會導致熒光素酶N端、C端靠近，恢復發光。