活體法檢測物體內硝酸還原酶活性實驗

實驗步驟：

一、材料儀器設備及試劑

1. 材料：水稻或小麥的葉片、幼穗等。

2. 儀器設備：真空抽氣泵；真空干燥器；小燒杯；玻璃瓶塞；其它用具同離體法。

3. 試劑及配制：

亞硝酸鈉標準液（與離體法相同）。

0.1mol·L－1KNO3（配制方法同離體法）。

1％磺胺（配制方法同離體法）；

0.02％萘基乙烯胺（配制方法同離體法）。

30％三氯乙酸溶液配制：稱取30g三氯乙酸，水溶后定容至100ml。

二、實驗步驟

1. 標準曲線制作 ( 同離體法)。

2. 酶促反應

（1）稱取作物葉片1.0～2.0g四份，剪成1cm左右的小段，分放于四個小燒杯中，用直徑略小于燒杯直徑的玻璃瓶塞將材料全部壓于杯底，其中一份作對照，另外三份作酶活性測定用。

（2） 先向對照杯中加入1ml 30％三氯乙酸，然后各杯中都加入9ml 0.1 mol·L－1KNO3溶液，混勻后立即放入干燥器中，抽氣1min再通入空氣，再抽真空，反復幾次，以排除組織間隙的氣體，至葉片完全軟化沉入杯底，以便底物溶液進入組織。最后通入氮氣密封后，在25℃黑暗中反應半小時，再分別向測定杯（對照杯除外）加入1ml 30％三氯乙酸終止酶反應。

3. 測定

將各杯搖勻靜置2分鐘后，各取2ml反應液到試管中，加入1ml 1﹪磺胺和1ml 0.02﹪萘基乙烯胺，搖勻顯色15min后，再倒入離心管中，在4000 r / min下離心15min，取上清液在520nm波長處測定吸光度（A）值。并從標準曲線查出反應液中的亞硝態氮含量（μg）。

三、酶活性計算 （ 同離體法）。

注意事項：

1. 硝酸還原酶容易失活，離體法測定時，操作應迅速，并且在4℃下進行。

2. 取樣宜在晴天進行，最好提前一天施用一定量的硝態氮肥，取樣部位應一致。

3. 硝酸鹽還原過程應在黑暗中進行，以防亞硝酸鹽還原為氨。

4. 從顯色到比色時間要一致，顯色時間過長或過短對顏色都有影響。