活體電穿孔法介紹（一）

1、什么是活體電穿孔
活體電穿孔法(in vivo electroporation) 是將外源基因通過電場作用，導入動物目標組織或器官。由于這種方法能有效導入外源基因，可在多種組織器官上應用,并且效率較高。活體電穿孔法的原理很簡單,在直流電場作用的瞬間,細胞膜表面產生疏水或親水的微小通道105～115μm ,這種通道能維持幾毫秒到幾秒,然后自行恢復。在此期間生物大分子如DNA 可通過這種微小的通道進入細胞 。近年來活體電穿孔法用于轉基因研究的報道不斷增多,在基因治療方面的優勢也日趨顯著,是一種很好的活體基因導入方法。

活體電穿孔法可用于檢測瞬時表達系統中載體的表達狀況。大量的研究表明活體電穿孔法在基因治療方面有非常好的應用前景。因此目前國內外對活體電穿孔法介導外源基因轉移的研究越來越多。

2、活體電穿孔的法的特點
活體電穿孔法基因導入和表達效率較高,它的特點主要在以下幾個方面:
首先,靶器官的選擇面廣,理論上任何組織和器官都可以作為活體電穿孔的靶器官。
   
在用于基因治療方面，要考慮到靶器官組織生理特性。如果所選擇的局部組織細胞不能把所轉移基因的表達產物分泌到外周血液循環中,則在某種意義上說已失去了基因導入的價值,這在基因治療中是關鍵性的問題。當使用組織特異性表達載體時,研究人員應根據所構建的表達載體來選擇基因轉移和表達的靶器官組織。例如魚精蛋白21 啟動子可指導外源基因在精母細胞中特異性表達,以小鼠的睪丸作為靶器官將含有魚精蛋白21啟動子的表達載體導入,獲得外源基因的表達量遠遠高于該基因在肝臟和骨骼肌中的表達。

其次,對導入的外源基因片段的大小沒有限制,從幾KB 或十幾KB 的表達載體, 到100～200KB 的YAC、BAC 基因組,都有成功導入并獲得表達的報道。

此外活體電穿孔法操作簡單快速,電穿孔的時間只有幾秒鐘,而且DNA片段不需要特殊的純化操作。但電穿孔法也存在一些的缺點:首先,外源基因表達持續的時間很短,雖然外源基因導入后最快可在215 小時有表達,但大多1～2 月后表達量降至很低。外源基因表達的時間主要由于所構建的表達載體和基因導入的靶細胞組織器官不同而存巨大差異。由于應用不同的表達載體,Muramatsu 在小鼠肝臟進行電穿孔7天后則檢測不到外源基因的表達,而Heller 21
天后還可以檢測到外源基因的表達。如果選擇代謝和酶活動旺盛的組織器官如肝臟,則表達持續時間會較短,表達時間在1 個月以內,但以骨骼肌為靶組織,表達可持續15個月。

3、 活體電穿孔法與其他活體基因導入方法的比較

到目前為止,非病毒載體的活體基因導入方法有直接注射法、脂質體法、基因槍法、電穿孔法等。每一種方法都有其各自的特殊性,因此很難將這幾種方法進行簡單的比較。

直接注射法：可將外源基因直接注射到靶位點或血管中,但此種方法不適合以肌肉作為靶器官,它的外源基因表達效率極低,僅為電穿孔法的百分之一。

脂質體法：活體基因轉移法中脂質體法更適宜較大面積組織的基因導入,但無法避免DNA濃度變低,在出血的情況下會使本來不高的DNA濃度更加降低,往往造成基因導入效率低。

基因槍法：適合于DNA較易接觸到的質地較堅韌的組織如皮膚,而視網膜、胚胎和禽類的胚盤等組織會由于機械刺激和出血造成器質性損傷或發育停滯,因而不能用基因槍法完成。DNA包裹的金屬顆粒從基因槍發出到達組織表面大多只幾百微米的距離,較深層的組織不易操作, 表達效率也較低。

Muramatsu報道在材料一致的情況下,電穿孔法的基因導入和表達效率明顯高于其它方法,而且電穿孔法適合多種組織的操作[3 ] 。

4 　活體電穿孔法施加條件的研究
波型的選擇
在電穿孔過程中方波較指數衰減波更能獲得較高的基因表達。同時方波只要要求控制電壓和時間，十分直觀，而指數衰減波需要控制的電壓、電容、電阻等參數，這樣的條件摸索過程中，方波較指數衰減波更易得到高表達。