如何免除活細胞標記中的清洗（washout）步驟？
SNAP-tag等標記方法為活細胞顯微成像帶來了革命性的變化，也因此被Nature雜志評為2004年最熱門的科研技術之一。但是傳統的SNAP-tag標記仍然有很大的缺陷。將帶有熒光探針的底物BG加入細胞后需要多次清洗細胞，才能將未結合的BG去除從而消除背景熒光對成像的影響。即不能實時在底物與SNAP-tag結合的過程中，跟蹤SNAP-tag融合蛋白的動態變化。YasuteruU等科學家基于SNAP-tag研發了一種熒光偶聯性激活標記方法（fluorescenceactivation-coupled protein labeling, FAPL），通過改造SNAP-tag的底物來解決這一問題，從而能夠實時的記錄細胞內一些動態的生命過程，如蛋白表達、定位、轉運及降解等過程[13-15]。在Snap-tag底物BG鳥嘌呤的C-8位置引入一個淬滅基團，可以有效的通過熒光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer，FRET)或光誘導電子轉移（Photoinduced electron transfer，PET）吸收BG上標記的熒光基團熒光能量，使其在與SNAP-tag結合之前是不會發出熒光的。一旦底物與SNAP-tag結合，該淬滅基團就會解離下來，熒光基團將發出熒光（圖4）。因此熒光信號只有在SNAP-tag融合蛋白上才會被點燃，所以也就不再需要任何的清洗步驟。Utrano及其同事已經成功的將這種標記方法應用于研究細胞運動中表皮生長因子受體（EGFR）相關的膜運輸過程（圖5）[13]。
圖3.HEK293活細胞中ATTO647N和Chromeo494分別標記的EGF和EGFR的STED超高分辨率成像。由圖E、F、K、L可以看出，STED對EGFR-EGR復合體的成像分辨率比共聚焦提高了3~4倍。
圖4. 傳統的SNAP-tag標記方法與基于FAPL的SNAP-tag標記方法比較
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