熒光信號由被檢細胞上標記的特異性熒光染料受激光激發后產生，發射的熒光波長與激發光波長不相同。每種熒光染料都有特定的激發波長，激發后又產生特定波長熒光。通過一些波長選擇通透性濾光片，可將不同波長的散射光、熒光信號區分開。選擇不同的單克隆抗體及熒光染料可以利用流式細胞儀同時測定一個細胞上的多個不同特征。
（一）熒光信號測量與放大器
線性放大器用于測量信號強度變化范圍較小的信號或具有生物學線性過程的信號，如前向散射光的測量與CD3+細胞DNA指數的測量。
對數放大器用于測量信號強度變化范圍較大且其光譜信號較復雜的信號，在免疫測量中最常使用。
（二）熒光補償
依靠濾光片是不能完全阻擋干擾信號，在每兩種熒光的發射光信號中仍有不可避免的重疊現象。該重疊區越大，信號檢測的準確性越差。通常采用熒光補償的方法來消除重疊信號，保證檢測信號的準確性。