一.睡眠性陣發性血紅蛋白尿PNH
睡眠性陣發性血紅蛋白尿（PNH）是一種獲得性造血干細胞異常，臨床主要表現為骨髓喪失造血功能、血栓、慢性溶血性貧血急性發作。PNH的發病率很低，發病原因不詳，可能與再生障礙性貧血有關系。PNH的臨床表現不一，疾病進程多變，給臨床的診斷治療和疾病研究帶來很多困難。最近15年，在PNH的細胞和分子生物學研究中取得了重要進展，定義了導致PNH異常表現的分子缺陷。而使用流式細胞儀進行PNH診斷分型，是PNH研究的又一里程碑。
（一）歷史回顧
Strubing早在一個世紀之前，就第一次報告了PNH，癥狀為溶血性貧血，伴有夜間血紅蛋白尿。50年后，Ham和Dingle證明了PNH患者的紅細胞在血清酸化條件下，易發生溶血，這就是現在普遍使用的Ham實驗，用來診斷PNH。不久，又發現PNH的溶血是由于患者的紅細胞對補體敏感。進而又發現PNH患者的中性粒細胞和血小板也有異常。Dacie在1963年提出了PNH是由于干細胞突變造成的獲得性克隆異常的假說。后來，通過對兩位患有PNH的婦女的異構酶葡萄糖6磷酸脫氫酶的研究，證實了這一假說。PNH紅細胞中只含有一種異構酶，而病人正常紅細胞中含有兩種異構酶。
（二）生化缺陷
1983年，PNH紅細胞的生化研究表明，PNH缺乏一種被稱為延遲加速因子DAF的補體調控蛋白。這種蛋白抑制補體C3轉換酶的形成，并通過glycophosphatidylinositol（GPI）的錨定作用（翻譯后處理步驟）固定在細胞膜上。進一步研究表明，PNH細胞缺少這種通過GPI與細胞膜的正常連接。這意味著，GPI錨定蛋白的合成異常，是PNH的起因。PNH細胞系的GPI合成的生化通路也異常，這種異常發生在通路的第一階段的N-acetylglucosamine到phosphatidylinositol的轉移過程中。
（三）分子缺陷
1993年Miyata等發現了PHN的基因缺陷。通過對一系列復雜的補體和轉染研究，證實了PNH細胞系的phosphatidylinositol glycan complementation class A（pig-a）基因表達了錯誤的GPI相關的抗原。對pig-a基因進行序列分析，發現迄今為止，所有報導過的PNH病人都有pig-a基因的突變。由于這種突變發生在體細胞，所以表現不一致，并且在整個pig-a編碼區域中，都有發生突變的可能。這些突變包括缺失、插入和點突變。所有的缺失和插入部分都很小（只有一到二個），導致漂移突變，產生了無功能產物。漂移突變導致了細胞完全缺乏GPI錨蛋白（III類細胞）。另一部分突變是點突變，保留部分活性，可以合成少部分的GPI錨蛋白。這種突變細胞表達部分GPI錨蛋白（II類細胞）。由于pig-a基因位于X染色體，每個細胞只有一個功能性pig-a基因（女性X染色體失活），因此，單一突變會造成GPI缺失表型。相反，每個細胞中都有兩個具有活性的常染色體pig基因，只有常染色體上兩個等位基因都發生突變，才會產生PNH癥狀。
（四）流式細胞儀分析
使用分子生物學已經成功發現了PNH的基因缺陷，而使用單克隆抗體和流式細胞儀技術則是發現診斷PNH表型異常的重要手段，具有同樣的重要意義。1985年，兩個各自獨立的小組使用流式細胞儀和DAF（CD55）抗體，調查PNH患者，發現了缺乏DAF的紅細胞、粒細胞、單核細胞、淋巴細胞和血小板。這都證明PNH的多系特征，有力支持PHN是克隆性干細胞疾病的學說。進一步分析PNH病人骨髓造血干細胞，發現也缺乏DAF的表達。之后，隨著新的GPI錨蛋白單克隆抗體的出現，PNH的研究又進一步深入。Van der Schoot等發現PNH患者中性粒細胞缺乏CD16、CD24和CD67（后來有更名為CD66b）。同時，他們第一次證明在PNH診斷中，流式細胞儀檢測優于Ham實驗。在研究中，他們分析了16例再生障礙性貧血的病人，在3例病人的粒細胞中發現了少量PNH克隆，而這3例病人Ham實驗均陰性。后來有人又進一步證實了一些嚴重再生障礙性貧血的病人有GPI缺乏的粒細胞和單核細胞，而紅細胞可以正常。于是，流式細胞儀診斷PNH的可靠方法很快建立起來，同時，還用來判斷PNH的疾病程度和PNH克隆的造血細胞系別來源。現在，盡管目前使用的流式細胞儀檢測技術在方法學和抗體選擇上還沒有統一，但它已經取代了Ham實驗，成為了PNH診斷的“金標準”。使用流式細胞儀可以發現Ham實驗陰性的再生障礙性貧血病人中存在的少量PNH細胞，這可以將PNH分為兩種情況：（1）溶血性PNH，特征是顯性溶血性貧血，同時有血紅蛋白尿。值得注意的是，這組病人中，有50%發生靜脈血栓，這是導致病人死亡的主要原因。（2）再生不良性PNH，可以檢出GPI缺乏的造血細胞，沒有顯性溶血，但可能有其它癥狀，如再生障礙性貧血、白細胞減少癥或血小板減少癥。這組病人中，有10%死于再生障礙性貧血。
很多病人由于同時具有以上兩組的癥狀，而不能單純分類歸于某一組。有一部分病人有再生不良性PNH，然后進展為溶血性PNH。另一小部分病人——但在臨床上很重要——首先就有血栓形成，臨床上卻沒有溶血癥狀。而且，發現及少數病人有先天性（非pig-a突變）GPI缺乏。一些研究小組也報導了Budd-Chiari綜合癥（肝靜脈栓塞）病人伴有PNH高發。很明顯，遇到病人血栓形成（如肝靜脈和腦靜脈）無法解釋時，應該排除PNH的可能。
二.PNH的實驗室診斷
? 基于紅細胞補體敏感性的實驗在有流式細胞術之前，PNH檢查主要依靠溶血實驗。Ham實驗、蔗糖溶血實驗和改進的Ham實驗的原理是：PNH紅細胞對溶血的敏感性與正常細胞不同。這些實驗雖然對溶血性PNH有效，但既不能有效檢測出PNH紅細胞含量少的樣本，也不能區分部分缺失和完全缺失的細胞。另外，由于輸血原因，且PNH紅細胞的壽命較短，以上這些實驗都不能對PNH克隆給予準確判斷。研究表明，通過流式細胞儀分析發現GPI缺乏的中性粒細胞，可以更加準確地判斷PNH克隆的情況。Ross及其同事于1906年代創建了補體溶血敏感實驗（CLS），這個實驗可以對PNH紅細胞的類型和比例給予更準確的判斷。但是，CLS實驗及費時費力，難于操作，不適合常規診斷。近來又改進方法，發展了DiaMed單克隆抗體膠技術，用于PNH篩查，它克服了一些CLS方法的技術難點。這一方法可以在血液病實驗室常規使用，但是與流式細胞儀方法比較，其靈敏度、特異性都要差一些。而且DiaMed方法仍然需要做大量的臨床實驗，來驗證方法的可靠性。
（一）流式細胞儀
使用流式細胞儀分析血細胞GPI錨蛋白，需要考慮設門的策略和抗體的選擇。而且，對于PNH檢測的結果的解釋，有賴于對GPI相關抗原在細胞上的分布和在造血細胞分化的不同階段有不同表達（見下表）的相關知識的了解。用流式細胞儀檢測PNH，并不是說在PNH細胞上，所有的診斷用抗原全都不表達。因此，應該所有細胞類型上篩查至少兩種GPI抗原，以排除先天性單一抗原缺乏的可能，同時排除技術原因造成的誤差。另外，應該使用跨膜抗原檢測做為陽性對照。
1.紅細胞分析：早期的研究檢測集中在紅細胞GPI相關抗原的表達上。原因有二。第一，疾病主要的臨床癥狀是溶血。第二，以往的PNH篩查實驗，如Ham實驗和蔗糖溶血實驗，是紅細胞檢查。PNH以前屬于于獲得性溶血性貧血，但是現在發現是屬于干細胞異常。盡管目前還沒有一致的設門策略，我們傾向于前向角散射光（FSC）和側向角散射光（SSC）使用對數放大模式，并根據紅細胞的物理特性，FSC/SSC設門。同時，檢測一個已知在所有紅細胞上都表達的非GPI相關的糖蛋白抗原，計算陽性百分率，用來判斷FSC/SSC設門的純度。與分析淋巴細胞、白細胞或干細胞的Boolean設門策略相比，這種設門方法不夠理想。在做紅細胞多色分析時，應該考慮紅細胞聚集造成的影響。細胞洗液和單抗試劑中有少量蛋白成分，容易使結合了抗體的紅細胞發生聚集。因此，我們選擇做單色分析。
在PNH紅細胞常規篩查實驗中，建議使用直標抗體，檢測兩種GPI相關抗原——CD55和CD59。如果檢測到陰性或部分缺失的細胞，一定是兩種GPI相關抗原同時缺失，才可以診斷PNH。這是因為，有一些少見的遺傳性缺失的病人可以缺少CD55或CD59之一。
分析未輸血的PNH病人，發現細胞可以明顯分為三種類型：III型細胞（完全缺失）、II型細胞（部分缺失）和I型細胞（正常表達）。不同病人的三型細胞的Mark設定可能會有所不同，有時三群細胞可能不能清楚地分開。
大多數PNH病人的粒細胞異常克隆比例大于紅細胞異常克隆。這是由于與正常紅細胞相比，PNH紅細胞的壽命較短，且輸血后，比例減少。近年來的研究表明，III型紅細胞的壽命為17-60天，II型紅細胞（CD59至少為正常細胞表達量的15%）可以較少產生補體介導的溶血反應。有趣的是，使用噻唑橙和CD59分析PNH患者的網織紅細胞，發現PNH網織紅細胞的比例與中性粒細胞克隆的比例相近。這說明，在PNH中，紅細胞和中性粒細胞的骨髓前體具有相似的增殖能力，檢測PNH患者的網織紅細胞可以提供有關紅細胞生成率的重要信息。很顯然，未來的流式細胞儀檢測趨勢是利用物理信號和熒光信號，建立一個更加有效的紅細胞設門策略。
2.粒細胞分析：以前對PNH粒細胞的研究主要是FSC/SSC設門的單色或雙色研究。盡管用此方法做單抗原分析是可行的，但是只利用粒細胞的物理特征進行設門可能會導致某些誤差。在許多PNH病歷中，普遍認為位于粒細胞門中的中性粒細胞占絕大多數。但是，有時也會存在有相當數量的嗜堿性粒細胞。在使用CD16單色分析含量較少的粒細胞PNH克隆時，誤差就暴露了，因為中性粒細胞CD16+，但正常嗜堿性粒細胞CD16-。FSC/SSC設門的另一個問題是，骨髓增生異常綜合癥時，會有許多無顆粒中性粒細胞，這時，只使用物理特征就無法設定粒細胞門了，這時必須使用系列標志/SSC設門。
最好使用三色分析檢測PNH粒細胞。檢測時，應該保證在操作過程中減少細胞丟失，同時使用SSC/非GPI相關蛋白的系列抗原（如CD15、CD33、CD45）設定粒細胞門，另外兩個熒光通道用來檢測GPI相關抗原。染色方法不完全一樣，如先染色后溶血，或先溶血后染色。先染色CD55、CD59時，比較難建立正確的抗體滴度，因為要同時染紅細胞和其它血細胞。使用氯化銨或其他溶血素先溶血的樣本，CD55和CD59抗體的滴度容易確定。CD16、CD24、CD66也是如此。同時使用CD16和CD66可以很清楚地區分出中性粒細胞和嗜堿性粒細胞。
紅細胞可以在4?C條件下保存25天，仍可以做實驗，而粒細胞分析則必須在樣本采集后幾小時內進行。CD59是分辨I型、II型、III型細胞的最好標志。但是，粒細胞的區分程度不如紅細胞明顯，而在許多PNH中性粒細胞上，CD16表達很弱。粒細胞在體外環境中放置，隨著細胞存活率的下降，細胞的非特異染色增強，自發熒光增強。雖然陰性同型對照在PNH檢測中不是必須的，但是，這對于分析粒細胞，尤其是陳舊樣本來講，是非常重要的。對于大多數PNH病例來講，樣本中殘留的少數正常中性粒細胞可以作為GPI缺失的PNH克隆的內參對照。另外，需要注意的是，在一些病例中，粒細胞和紅細胞GPI表型不一致，粒細胞部分缺失，而紅細胞完全缺失或者是II型細胞和III型細胞的混合表型。
3.單核細胞分析：有一些研究小組分析了PNH病人的外周血單核細胞，發現散射光門內的PNH單核細胞缺少CD14、CD55、CD59或CD48。其中CD14和CD55是比較多見的檢測抗體。由于細胞起源相同，PNH單核細胞克隆和PNH粒細胞克隆的一致性很好。但是，Alfinito等報告，與PNH粒細胞相比，CD14-的單核細胞比例較高。而且，CD14+單核細胞（正常細胞）的百分含量與血紅蛋白和血小板含量正相關，而且CD14+細胞<10%的病人有活動期癥狀。檢測GPI相關抗原部分缺失的單核細胞很困難，只有CD48可以有中間狀態的染色。由于PNH病人的單核細胞的數量通常都比較低，在檢測時很難獲取到足夠量的單核細胞。做PNH單核細胞分析時，可以使用系列標記/SSC設門。由于CD14是GPI錨抗原，所以不能用于設門；CD64（Fc?RI）、CD33和CD4可以用來設門。在多色分析時，可以使用CD14 dim/SSC low或CD33 bright/ SSC low設定單核細胞門，然后分析門內細胞的CD14、CD55、CD59和CD52的表達。使用這種方法，可以清楚地分析出單核細胞PNH克隆的CD14表達缺失。分析表明，單核細胞PNH克隆與粒細胞PHN克隆相近。
4.淋巴細胞分析：使用流式細胞儀多色分析，發現很多PNH病人有缺乏GPI的淋巴細胞，尤其是病程較長的病人。與粒細胞PNH克隆相比，PNH T、B、NK細胞一般含量很少。這可能是因為PNH發病前就生成的正常T、B淋巴細胞的壽命較長。在診斷PNH時，不建議只檢測淋巴細胞上GPI相關蛋白的表達。在正常T淋巴細胞中，CD55和CD59的表達水平不一致。使用CD48，可以明顯區分正常細胞和PNH T、B、NK細胞。
5.血小板分析：PNH病人多發生血栓，是主要的致死原因。GPI錨蛋白與血管內溶血無疑是相關聯的，但目前仍沒有一個好的機理可以解釋這種關系。而且，也不清楚為什么在某些解剖部位（如腹內和/或肝靜脈）多發生血栓。當前主要研究血小板缺乏GPI-anchored urokinase plasminogen activator receptor（Upar，CD87）和其它GPI相關補體調節蛋白（CD55或CD59）是一種可能原因。此溶血/血栓形成過程的生化性質還不是很清楚。
同紅細胞和粒細胞分析一樣，文獻報導中，PNH血小板分析沒有獲得一致意見，研究只限于在富血小板血漿（PRP）中加入或不加入某些試劑，抑制血小板活化。
少數一些人研究了PNH病人血小板的CD55和CD59的表達。這些研究主要使用FSC/SSC設門，同時使用非GPI相關蛋白的抗體（CD42b或CD61）評估設門效果。正常血小板的CD59和CD55的表達比較弱，正常血小板中約有10%不表達CD59和CD55。這種表達缺失，是真性的，還是由于技術限制造成的，目前還不清楚。因此，PNH病人檢測GPI缺乏的血小板不容易分辨，II型細胞與III型細胞也很難區分。有報導說去除PRP中的紅細胞可以提高實驗的靈敏度。Maciejewski等做雙色分析，使用CD42a和CD42b辨認血小板，并分析了正常血小板和PNH血小板的CD55和CD59。樣本放置保存，觀察5天，發現兩種GPI相關抗原的水平均下降。結果表明，大多數P