一 . 睡眠性陣發性血紅蛋白尿 PNH
睡眠性陣發性血紅蛋白尿（ PNH ）是一種獲得性造血干細胞異常，臨床主要表現為骨髓喪失造血功能、血栓、慢性溶血性貧血急性發作。 PNH 的發病率很低，發病原因不詳，可能與再生障礙性貧血有關系。 PNH 的臨床表現不一，疾病進程多變，給臨床的診斷治療和疾病研究帶來很多困難。最近 15 年，在 PNH 的細胞和分子生物學研究中取得了重要進展，定義了導致 PNH 異常表現的分子缺陷。而使用流式細胞儀進行 PNH 診斷分型，是 PNH 研究的又一里程碑。
（一）歷史回顧
Strubing 早在一個世紀之前，就第一次報告了 PNH ，癥狀為溶血性貧血，伴有夜間血紅蛋白尿。 50 年后， Ham 和 Dingle 證明了 PNH 患者的紅細胞在血清酸化條件下，易發生溶血，這就是現在普遍使用的 Ham 實驗，用來診斷 PNH 。不久，又發現 PNH 的溶血是由于患者的紅細胞對補體敏感。進而又發現 PNH 患者的中性粒細胞和血小板也有異常。 Dacie 在 1963 年提出了 PNH 是由于干細胞突變造成的獲得性克隆異常的假說。后來，通過對兩位患有 PNH 的婦女的異構酶葡萄糖 6磷酸脫氫酶的研究，證實了這一假說。 PNH 紅細胞中只含有一種異構酶，而病人正常紅細胞中含有兩種異構酶。
（二）生化缺陷
1983 年， PNH 紅細胞的生化研究表明， PNH 缺乏一種被稱為延遲加速因子 DAF 的補體調控蛋白。這種蛋白抑制補體 C3 轉換酶的形成，并通過 glycophosphatidylinositol （ GPI ）的錨定作用（翻譯后處理步驟）固定在細胞膜上。進一步研究表明， PNH 細胞缺少這種通過 GPI 與細胞膜的正常連接。這意味著， GPI 錨定蛋白的合成異常，是 PNH 的起因。 PNH 細胞系的 GPI 合成的生化通路也異常，這種異常發生在通路的第一階段的 N-acetylglucosamine 到 phosphatidylinositol 的轉移過程中。
（三）分子缺陷
1993 年 Miyata 等發現了 PHN 的基因缺陷。通過對一系列復雜的補體和轉染研究，證實了PNH 細胞系的 phosphatidylinositol glycan complementation class A （ pig-a ）基因表達了錯誤的 GPI 相關的抗原。對 pig-a 基因進行序列分析，發現迄今為止，所有報導過的 PNH 病人都有pig-a 基因的突變。由于這種突變發生在體細胞，所以表現不一致，并且在整個 pig-a 編碼區域中，都有發生突變的可能。這些突變包括缺失、插入和點突變。所有的缺失和插入部分都很小（只有一到二個），導致漂移突變，產生了無功能產物。漂移突變導致了細胞完全缺乏 GPI 錨蛋白（ III 類細胞）。另一部分突變是點突變，保留部分活性，可以合成少部分的 GPI 錨蛋白。這種突變細胞表達部分 GPI 錨蛋白（ II 類細胞）。由于 pig-a 基因位于 X 染色體，每個細胞只有一個功能性 pig-a 基因（女性 X 染色體失活），因此，單一突變會造成 GPI 缺失表型。相反，每個細胞中都有兩個具有活性的常染色體 pig 基因，只有常染色體上兩個等位基因都發生突變，才會產生 PNH 癥狀。
（四）流式細胞儀分析
使用分子生物學已經成功發現了 PNH 的基因缺陷，而使用單克隆抗體和流式細胞儀技術則是發現診斷 PNH 表型異常的重要手段，具有同樣的重要意義。 1985 年，兩個各自獨立的小組使用流式細胞儀和 DAF （ CD55 ）抗體，調查 PNH 患者，發現了缺乏 DAF 的紅細胞、粒細胞、單核細胞、淋巴細胞和血小板。這都證明 PNH 的多系特征，有力支持 PHN 是克隆性干細胞疾病的學說。進一步分析 PNH 病人骨髓造血干細胞，發現也缺乏 DAF 的表達。之后，隨著新的 GPI 錨蛋白單克隆抗體的出現， PNH 的研究又進一步深入。 Van der Schoot 等發現 PNH 患者中性粒細胞缺乏 CD16、 CD24 和 CD67 （后來有更名為 CD66b ）。同時，他們第一次證明在 PNH 診斷中，流式細胞儀檢測優于 Ham 實驗。在研究中，他們分析了 16 例再生障礙性貧血的病人，在 3 例病人的粒細胞中發現了少量 PNH 克隆，而這 3 例病人 Ham 實驗均陰性。后來有人又進一步證實了一些嚴重再生障礙性貧血的病人有 GPI 缺乏的粒細胞和單核細胞，而紅細胞可以正常。于是，流式細胞儀診斷 PNH的可靠方法很快建立起來，同時，還用來判斷 PNH 的疾病程度和 PNH 克隆的造血細胞系別來源。現在，盡管目前使用的流式細胞儀檢測技術在方法學和抗體選擇上還沒有統一，但它已經取代了Ham 實驗，成為了 PNH 診斷的“金標準”。使用流式細胞儀可以發現 Ham 實驗陰性的再生障礙性貧血病人中存在的少量 PNH 細胞，這可以將 PNH 分為兩種情況：（ 1 ）溶血性 PNH ，特征是顯性溶血性貧血，同時有血紅蛋白尿。值得注意的是，這組病人中，有 50% 發生靜脈血栓，這是導致病人死亡的主要原因。（ 2 ）再生不良性 PNH ，可以檢出 GPI 缺乏的造血細胞，沒有顯性溶血，但可能有其它癥狀，如再生障礙性貧血、白細胞減少癥或血小板減少癥。這組病人中，有 10% 死于再生障礙性貧血。
很多病人由于同時具有以上兩組的癥狀，而不能單純分類歸于某一組。有一部分病人有再生不良性 PNH ，然后進展為溶血性 PNH 。另一小部分病人――但在臨床上很重要――首先就有血栓形成，臨床上卻沒有溶血癥狀。而且，發現及少數病人有先天性（非 pig-a 突變） GPI 缺乏。一些研究小組也報導了 Budd-Chiari 綜合癥（肝靜脈栓塞）病人伴有 PNH 高發。很明顯，遇到病人血栓形成（如肝靜脈和腦靜脈）無法解釋時，應該排除 PNH 的可能。
二 .PNH 的實驗室診斷
? 基于紅細胞補體敏感性的實驗在有流式細胞術之前， PNH 檢查主要依靠溶血實驗。 Ham 實驗、蔗糖溶血實驗和改進的 Ham 實驗的原理是： PNH 紅細胞對溶血的敏感性與正常細胞不同。這些實驗雖然對溶血性 PNH 有效，但既不能有效檢測出 PNH 紅細胞含量少的樣本，也不能區分部分缺失和完全缺失的細胞。另外，由于輸血原因，且 PNH 紅細胞的壽命較短，以上這些實驗都不能對PNH 克隆給予準確判斷。研究表明，通過流式細胞儀分析發現 GPI 缺乏的中性粒細胞，可以更加準確地判斷 PNH 克隆的情況。 Ross 及其同事于 1906 年代創建了補體溶血敏感實驗（ CLS ），這個實驗可以對 PNH 紅細胞的類型和比例給予更準確的判斷。但是， CLS 實驗及費時費力，難于操作，不適合常規診斷。近來又改進方法，發展了 DiaMed 單克隆抗體膠技術，用于 PNH 篩查，它克服了一些 CLS 方法的技術難點。這一方法可以在血液病實驗室常規使用，但是與流式細胞儀方法比較，其靈敏度、特異性都要差一些。而且 DiaMed 方法仍然需要做大量的臨床實驗，來驗證方法的可靠性。
（一）流式細胞儀
使用流式細胞儀分析血細胞 GPI 錨蛋白，需要考慮設門的策略和抗體的選擇。而且，對于 PNH檢測的結果的解釋，有賴于對 GPI 相關抗原在細胞上的分布和在造血細胞分化的不同階段有不同表達（見下表）的相關知識的了解。用流式細胞儀檢測 PNH ，并不是說在 PNH 細胞上，所有的診斷用抗原全都不表達。因此，應該所有細胞類型上篩查至少兩種 GPI 抗原，以排除先天性單一抗原缺乏的可能，同時排除技術原因造成的誤差。另外，應該使用跨膜抗原檢測做為陽性對照。
1. 紅細胞分析：早期的研究檢測集中在紅細胞 GPI 相關抗原的表達上。原因有二。第一，疾病主要的臨床癥狀是溶血。第二，以往的 PNH 篩查實驗，如 Ham 實驗和蔗糖溶血實驗，是紅細胞檢查。PNH 以前屬于于獲得性溶血性貧血，但是現在發現是屬于干細胞異常。盡管目前還沒有一致的設門策略，我們傾向于前向角散射光（ FSC ）和側向角散射光（ SSC ）使用對數放大模式，并根據紅細胞的物理特性， FSC/SSC 設門。同時，檢測一個已知在所有紅細胞上都表達的非 GPI 相關的糖蛋白抗原，計算陽性百分率，用來判斷 FSC/SSC 設門的純度。與分析淋巴細胞、白細胞或干細胞的Boolean 設門策略相比，這種設門方法不夠理想。在做紅細胞多色分析時，應該考慮紅細胞聚集造成的影響。細胞洗液和單抗試劑中有少量蛋白成分，容易使結合了抗體的紅細胞發生聚集。因此，我們選擇做單色分析。
在 PNH 紅細胞常規篩查實驗中，建議使用直標抗體，檢測兩種 GPI 相關抗原―― CD55 和 CD59 。如果檢測到陰性或部分缺失的細胞，一定是兩種 GPI 相關抗原同時缺失，才可以診斷 PNH 。這是因為，有一些少見的遺傳性缺失的病人可以缺少 CD55 或 CD59 之一。
分析未輸血的 PNH 病人，發現細胞可以明顯分為三種類型： III 型細胞（完全缺失）、 II 型細胞（部分缺失）和 I 型細胞（正常表達）。不同病人的三型細胞的 Mark 設定可能會有所不同，有時三群細胞可能不能清楚地分開。
大多數 PNH 病人的粒細胞異常克隆比例大于紅細胞異常克隆。這是由于與正常紅細胞相比，PNH 紅細胞的壽命較短，且輸血后，比例減少。近年來的研究表明， III 型紅細胞的壽命為 17-60天， II 型紅細胞（ CD59 至少為正常細胞表達量的 15% ）可以較少產生補體介導的溶血反應。有趣的是，使用噻唑橙和 CD59 分析 PNH 患者的網織紅細胞，發現 PNH 網織紅細胞的比例與中性粒細胞克隆的比例相近。這說明，在 PNH 中，紅細胞和中性粒細胞的骨髓前體具有相似的增殖能力，檢測 PNH 患者的網織紅細胞可以提供有關紅細胞生成率的重要信息。很顯然，未來的流式細胞儀檢測趨勢是利用物理信號和熒光信號，建立一個更加有效的紅細胞設門策略。
2. 粒細胞分析：以前對 PNH 粒細胞的研究主要是 FSC/SSC 設門的單色或雙色研究。盡管用此方法做單抗原分析是可行的，但是只利用粒細胞的物理特征進行設門可能會導致某些誤差。在許多 PNH病歷中，普遍認為位于粒細胞門中的中性粒細胞占絕大多數。但是，有時也會存在有相