實驗概要
為了便于對瘧原蟲侵襲紅細胞表型的分析，我們開發出基于兩色流式細胞儀區分寄生蟲入侵和寄生蟲生長的新平臺。使用酶處理后，用染料CFDASE或DDAO SE標記靶細胞的一個或多個受體。培養惡性瘧原蟲的寄生蟲，對寄生蟲入侵細胞與熒光DNA插層染料 Hoechst 33342或SYBR Green標記并進行檢測。標記紅細胞的干擾入侵，細胞和寄生蟲染料的組合概括為三個標準的入侵表型。以最小的重疊組合驗證了三種不同的染料，這意味著同樣的實驗，可以適應不同儀器的幾種激光線的組合。該法是敏感的，在96孔板中，可以用來定量自然紅細胞入侵效率或實驗的遺傳變異的影響。
實驗步驟
標記目標紅細胞：
根據選擇的DNA染料選擇對目標紅細胞的熒光標記，這本身就取決于流式細胞儀在入侵檢測分析結束時獲得的數據，CFDA SE的熒光發射峰約為517nm，接近520nm處SYBR Green I的熒光。CFDASE可以與Hoechst 33342組合使用，DDAO SE 的熒光發射峰接近657nm。因此，它可以與Hoechst 33342或SYBR Green I組合使用。
1．加入12mL RPMI 1640和0.5mL水洗紅細胞到50mL管中輕輕混勻，獲得2％比容的血細胞和。
2．將3mL 2％比容紅細胞懸浮液轉移到15mL標有“染色紅細胞 ”的管中，離心3分鐘。
3．吸取并棄掉離心管的上清液。
4．加入3.1mL 的RPMI 1640到15mL標有“CFDA的”管（或“DDAO”）。
5．加入12.4μL含5mM CFDA SE的二甲基亞砜（或6.2μL5mM DDAO SE的二甲基亞砜）至“CFDA” 管（或“DDAO”）獲得20μM混懸溶液（或10μM），然后混合。
6．加入3 mL 20μMCFDA SE（或10μM DDAO SE）至“染色紅細胞 ”管，并立即上下吹吸使得溶液混合。
7．將試管放置在震蕩儀上，旋轉開關，以最大的速度在37°C培育2h。
8．離心“染色紅細胞”管3分鐘。
9．吸取并棄掉所有上清液。
10．加入3 mL完全培養基和懸浮細胞沉淀。
11．離心3分鐘。
12．吸取并棄掉所有上清液。
13．加入3 mL完全培養基和懸浮細胞沉淀。
14．將試管放置在震蕩儀上，旋轉開關，以最大的速度在37°C培育2h。
15．離心3分鐘。
16．吸取并棄掉所有上清液。
17．加入3 mL完全培養基和懸浮細胞沉淀。
18．離心3分鐘。
19．重復步驟16至18一次。
20．吸取并棄掉所有上清液。
21．加入3 mL不完全培養基，并吸取和懸浮細胞沉淀。
酶法處理：
1．從“染色紅細胞”試管中吸取400μL細胞懸液轉移到標記“A”到“F”的離心管中。
2．加入含1U/mL神經氨酸苷酶的RPMI 1640 溶液8μL管B和管E 。
3．將6個試管放置在震蕩儀上，旋轉開關，以最大的速度在37°C培育1h。
4．用臺式微量離心機離心試管。
5．吸出并丟棄上清。
6．加入400μL不完全培養基至6個試管中用臺式微量離心機離心30s。
7．吸出并丟棄所有管中的上清。
8．加入400μL不完全培養基至6個試管中懸浮沉淀。
9．加入2μL 10mg/ml蛋白酶0至C試管，加入40μL 10mg/ml蛋白酶至D、E試管，40μL 10mg/ml的糜蛋白酶至管F。
10．將6個試管放置在震蕩儀上，旋轉開關，以最大的速度在37°C培育1h。
11．將6個試管用臺式微量離心機離心30s。
12．吸出并丟棄上清液。
13．加入400μL不完全培養基至6個試管中用臺式微量離心機離心30s。
14．重復步驟12和13一次。
15．吸出并丟棄上清液。
16．加入400μL不完全培養基，吹打細胞，懸浮顆粒。
標記培養板和培養：
1．在96孔板蓋子的頂部標記18個孔從A至E和1至3 。
2．加入大約200μL PBS至78個未標記的孔中。
3．加入50μL donor pRBC至2％比容，1-2％的原蟲血癥至18孔標記的細胞板，并標記為A1至F3。
4．旋轉板180度。
5．加入50μL 目標紅細胞至2％比容至相應的孔。（如從離心管中吸取50μL到每個孔A1，A2和A3）6．小心翼翼地取向上和向下吹吸18孔的混合溶液，避免氣泡。
6．將培養板放入培養箱，37°C預熱。
7．取出培養板，加入1％O2，3％二氧化碳平衡氮氣3分鐘。
8．將板放入培養箱，在37°C孵育48小時。
寄生蟲染色：
如果目標紅細胞用CFDA SE進行染色，寄生蟲染色必須用Hoechst 33342。如果目標紅細胞染色用DDAO SE，根據流式細胞儀上的激光線，染色寄生蟲可用Hoechst 33342或SYBR Green 1 。
下面是SYBR Green I染色的過程：
1．離心3分鐘。
2．吸取并棄掉18孔50μL 培養上清液并標記為A1至F3。
3．在18孔中加入200μL的PBS并離心3分鐘。
4．吸取并棄掉18孔200μL 培養上清液。
5．加入200μL含 2％paraformaldehyde/0.2％戊二醛的PBS，重懸浮細胞沉淀，在4℃的孵育1h 。6．離心3分。重懸浮細胞沉淀。
6．吸取并棄掉18孔200μL 培養上清液。
7．18孔每孔加入200μL的PBS并離心3分鐘。
8．吸取并棄掉18孔200μL 培養上清液。
9．18孔，每孔加入200μL含0.3％Triton X-100 的PBS，重懸浮細胞沉淀，室溫孵育10分鐘。11．離心3分鐘。
10．吸取并棄掉18孔200μL 培養上清液。
11．18孔每孔加入200μL的PBS并離心3分鐘。
12．吸取并棄掉18孔200μL 培養上清液。
13．18孔，每孔加入200μL含0.5mg/ml核糖核酸的PBS，重懸浮細胞沉淀，37°C孵育1h。16℃離心3分鐘。
14．吸取并棄掉18孔200μL 培養上清液。
15．加入200μL的PBS離心3分鐘。
16．吸取并棄掉18孔200μL 培養上清液。
17．18孔，每孔加入200μL 1：5,000的 SYBR Green I，重懸浮細胞沉淀，37°C孵育1小時。
18. 離心3分鐘。
19．吸取并棄掉18孔200μL 培養上清液。
20．加入200μL的PBS離心3分鐘。
21．重復步驟22和23兩次以上。
22．吸取并棄掉18孔200μL 培養上清液。
23．18孔，每孔加入200μL PBS，重懸浮細胞顆粒。
流式細胞儀測試：
1． 96孔板在平底板上的蓋子上標記18孔，從A1到F3。
2．18孔，每孔加入250μL PBS。
3．從18孔中吸取25μL染色細胞進行入侵檢測，再把它加入新的培養板中只包含PBS。
4．吹吸混合，稀釋細胞懸液。
5．采集能在流式細胞儀上產生適當激光線的稀釋的細胞懸液，進行熒光標記和DNA染料選擇（獲得10萬事件最低得到50000靶細胞進行分析）。
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